1. Hiểu biết ban đầu

Ở giai đoạn này, chúng ta cần hiểu một số khái niệm, thuật ngữ để tránh mắc lỗi trước mặt đàn anh, như:

Hỏi: Sự khác biệt giữa RT-PCR, qPCR, Real-time PCR và real-time RT-PCR là gì?

Trả lời: RT-PCR là PCR phiên mã ngược(PCR phiên mã ngược, RT-PCR), là một biến thể được sử dụng rộng rãi của phản ứng chuỗi polymerase (PCR).Trong RT-PCR, một chuỗi RNA được phiên mã ngược thành DNA bổ sung, sau đó được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại DNA bằng PCR.
Real-time-PCR và qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) đều giống nhau, cả hai đều là PCR định lượng thời gian thực, nghĩa là mỗi chu kỳ PCR đều có bản ghi dữ liệu thời gian thực, do đó số lượng mẫu bắt đầu có thể được điều chỉnh để phân tích chính xác.

Mặc dù cả Real-time PCR (PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực) và Reverse transcript PCR (PCR phiên mã ngược) dường như được viết tắt là RT-PCR, quy ước quốc tế là: RT-PCR đặc biệt đề cập đến phiên mã ngược.PCR, Real-time PCR thường được viết tắt là qPCR (quantitative real-time PCR).

Và real-time RT-PCR (RT-qPCR), Là PCR phiên mã ngược kết hợp với công nghệ định lượng huỳnh quang: đầu tiên thu được cDNA (RT) từ phiên mã ngược RNA, sau đó sử dụng Real-time PCR để phân tích định lượng (qPCR).Hầu hết các phòng thí nghiệm đều thực hiện RT-qPCR, tức là nghiên cứu về điều chỉnh giảm biểu hiện RNA, vì vậy qPCR mà mọi người nói đến trong phòng thí nghiệm thực chất là đề cập đến RT-qPCR, nhưng đừng quên rằng vẫn còn nhiều xét nghiệm DNA trong các ứng dụng lâm sàng.Phân tích định lượng, chẳng hạn như phát hiện virus viêm gan B HBV.

Câu hỏi: Sau khi đọc rất nhiều PCR định lượng huỳnh quang, tại sao đoạn khuếch đại phải được kiểm soát trong khoảng 80-300bp?

Trả lời: Độ dài của mỗi trình tự gen là khác nhau, có đoạn vài kb, có đoạn hàng trăm bp, nhưng chúng ta chỉ cần yêu cầu chiều dài sản phẩm là 80-300bp khi thiết kế mồi, quá ngắn hoặc quá dài đều không phù hợp để phát hiện PCR định lượng huỳnh quang.Đoạn sản phẩm quá ngắn để có thể phân biệt được với primer-dimer.Độ dài của primer-dimer khoảng 30-40bp và rất khó để phân biệt đó là primer-dimer hay sản phẩm nếu nó nhỏ hơn 80bp.Nếu đoạn sản phẩm quá dài, vượt quá 300bp sẽ dễ dẫn đến hiệu suất khuếch đại thấp và không thể phát hiện hiệu quả số lượng gen.

Ví dụ, khi bạn đếm có bao nhiêu người trong một lớp học, bạn chỉ cần đếm xem có bao nhiêu cái miệng.Điều này cũng đúng khi bạn phát hiện gen, bạn chỉ cần phát hiện một trình tự nhất định của một gen để đại diện cho Toàn bộ trình tự sẽ làm được.Muốn đếm người thì phải đếm cả miệng và mũi, tai, kính, rất dễ sai sót.

Mở rộng ra, trong nghiên cứu sinh học, có nhiều trường hợp nghiên cứu từ điểm này sang khu vực khác, vì trình tự gen của bất kỳ loài nào cũng rất dài, không cần thiết và không thể đo lường tất cả các đoạn, chẳng hạn như giải trình tự 16S của vi khuẩn, là tiến hành xét nghiệm trình tự bảo thủ của vi khuẩn để suy ra số lượng của một quần thể vi khuẩn nhất định.

Hỏi: Độ dài tối ưu cho thiết kế đoạn mồi qPCR là bao nhiêu?

Trả lời: Nói chung, độ dài mồi khoảng 20-24bp thì tốt hơn.Tất nhiên, chúng ta phải chú ý đến giá trị TM của mồi khi thiết kế mồi, bởi vì điều này có liên quan đến nhiệt độ ủ tối ưu.Sau rất nhiều thử nghiệm, người ta đã chứng minh rằng 60°C là giá trị TM tốt hơn.Nếu nhiệt độ ủ quá thấp sẽ dễ dẫn đến hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu.Nếu nhiệt độ ủ quá cao, hiệu suất khuếch đại sẽ tương đối thấp, đỉnh của đường cong khuếch đại sẽ bắt đầu muộn hơn và giá trị CT sẽ bị trễ.

Q: Phương pháp nhuộm khác với phương pháp thăm dò như thế nào?

Trả lời: Phương pháp nhuộm màuMột số thuốc nhuộm huỳnh quang, chẳng hạn như SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, v.v., không tự phát ra ánh sáng mà sẽ phát ra huỳnh quang sau khi liên kết với rãnh nhỏ của DNA sợi kép.Do đó, khi bắt đầu phản ứng PCR, máy không phát hiện được tín hiệu huỳnh quang.Khi phản ứng đạt đến giai đoạn kéo dài ủ, chuỗi kép được mở ra và một chuỗi mới được tổng hợp dưới tác động của DNA polymerase và phân tử huỳnh quang liên kết với rãnh nhỏ của DSDNA.Khi số chu kỳ PCR tăng lên, ngày càng có nhiều thuốc nhuộm được kết hợp với DNA sợi kép và tín hiệu huỳnh quang cũng liên tục được tăng cường.Phương pháp nhuộm chủ yếu được sử dụng trong nghiên cứu khoa học.
Tái bút: Làm thí nghiệm cẩn thận một chút, thuốc nhuộm phải cùng người DNA kết hợp, cẩn thận biến thành người huỳnh quang.

Phương pháp nhuộm (trái) Phương pháp thăm dò (phải)
Tái bút: Làm thí nghiệm cẩn thận một chút, thuốc nhuộm phải cùng người DNA kết hợp, cẩn thận biến thành người huỳnh quang.

SYBR Green Ⅰ liên kết với rãnh nhỏ của DNA

phương pháp thăm dòĐầu dò Taqman là đầu dò thủy phân được sử dụng phổ biến nhất.Có một nhóm huỳnh quang ở đầu 5′ của mẫu dò, thường là FAM, và bản thân mẫu dò là một trình tự bổ sung cho gen mục tiêu.Có một nhóm dập tắt huỳnh quang ở đầu 3′.Theo nguyên tắc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (truyền năng lượng cộng hưởng Forster, FRET), khi nhóm huỳnh quang báo cáo (phân tử huỳnh quang cho) và nhóm huỳnh quang dập tắt (phân tử huỳnh quang nhận) bị kích thích Khi phổ trùng nhau và khoảng cách rất gần (7-10nm), sự kích thích của phân tử cho có thể gây ra sự phát huỳnh quang của phân tử nhận, trong khi quá trình tự phát huỳnh quang bị suy yếu.Do đó, khi bắt đầu phản ứng PCR, khi mẫu dò tự do và còn nguyên vẹn trong hệ thống, nhóm huỳnh quang báo cáo sẽ không phát ra huỳnh quang.Khi ủ, mồi và mẫu dò liên kết với mẫu.Trong giai đoạn mở rộng, polymerase liên tục tổng hợp chuỗi mới.DNA polymerase có hoạt tính exonuclease 5′-3′.Khi đến mẫu dò, DNA polymerase sẽ thủy phân mẫu dò khỏi mẫu, tách nhóm huỳnh quang báo cáo khỏi nhóm huỳnh quang dập tắt và giải phóng tín hiệu huỳnh quang.Vì có mối quan hệ một đối một giữa đầu dò và mẫu, nên phương pháp đầu dò vượt trội hơn phương pháp nhuộm về độ chính xác và độ nhạy của xét nghiệm.Phương pháp thăm dò được sử dụng chủ yếu trong chẩn đoán.

Q: Định lượng tuyệt đối là gì?Định lượng tương đối là gì?

Trả lời: Định lượng tuyệt đối đề cập đến việc tính toán số lượng bản sao ban đầu của mẫu sẽ được kiểm tra bằng qPCR, chẳng hạn như có bao nhiêu vi-rút HBV trong 1ml máu.Kết quả thu được bằng cách định lượng tương đối là sự thay đổi về lượng gen mục tiêu trong một mẫu cụ thể so với mẫu tham chiếu khác và biểu hiện gen được điều chỉnh tăng hoặc giảm.

Hỏi: Lượng chiết xuất RNA, hiệu suất phiên mã ngược và hiệu suất khuếch đại có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm không?
Q: Lưu trữ mẫu, thuốc thử chiết xuất, thuốc thử phiên mã ngược và vật tư truyền ánh sáng có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm không?
Q: Phương pháp nào có thể sửa dữ liệu thử nghiệm?

Về các vấn đề này, chúng tôi sẽ mô tả chi tiết trong phần nâng cao và nâng cao bên dưới.
2. Kiến thức nâng cao

Nói về real-time PCR định lượng huỳnh quang, chúng ta phải nhìn nhận một thực tế là hàng năm có hàng nghìn công trình nghiên cứu khoa học được công bố, trong đó công nghệ PCR định lượng huỳnh quang chiếm một con số không hề nhỏ.

Nếu không có tiêu chuẩn chung để đo thí nghiệm PCR định lượng huỳnh quang, kết quả có thể rất khác nhau.Đối với cùng một gen của cùng một loài, với cùng một phương pháp xử lý, kết quả phát hiện cũng sẽ khác nhau rất nhiều và người đến sau khó có thể lặp lại kết quả tương tự.Bạn Không ai biết cái nào đúng và cái nào sai.

Điều này có nghĩa là PCR định lượng huỳnh quang là một công nghệ gian lận hoặc một công nghệ không đáng tin cậy?Không, đó là vì PCR định lượng huỳnh quang nhạy hơn và chính xác hơn, thao tác sai một chút sẽ cho ra kết quả hoàn toàn ngược lại.Mất mát nhỏ cách xa vạn dặm.Tác giả của bài báo có thể bị tra tấn nhiều lần bởi những người phản biện.Đồng thời, người bình duyệt tạp chí cũng khó lựa chọn giữa các kết quả thực nghiệm khác nhau.

Nói chung, chỉ ra sự thiếu đồng thuận trong các thí nghiệm PCR thời gian thực.Cuối cùng, các nhà khoa học cao cấp trong ngành bắt đầu xây dựng các tiêu chuẩn,yêu cầu những người đóng góp cung cấp một số chi tiết thử nghiệm và xử lý dữ liệu cần thiết (bao gồm cả dữ liệu cần thiết) trong bài viết để đáp ứng các tiêu chuẩn này.

Người đánh giá có thể đánh giá chất lượng của thử nghiệm bằng cách đọc các chi tiết này;độc giả trong tương lai cũng có thể sử dụng điều này để lặp lại thử nghiệm hoặc cải thiện thử nghiệm.Sau đó, các kết quả thử nghiệm thu được theo cách này có đầy đủ thông tin, chất lượng cao và có thể sử dụng được.

MIBBI (Thông tin tối thiểu cho điều tra sinh học và y sinh -http://www.mibbi.org) ra đời.MIBBI là một dự án cung cấp các tiêu chuẩn cho các thí nghiệm.Nó được xuất bản trong tự nhiên.Dự án này nhằm vào các thí nghiệm sinh học khác nhau, bao gồm sinh học tế bào, Microarray, qPCR mà chúng ta sẽ thảo luận ngay bây giờ, v.v. và cung cấp cho từng loại thí nghiệm khi gửi bản thảo.Thông tin đó nên được cung cấp mọi lúc.

Trong dự án MIBBI có 2 bài viết liên quan đến PCR định lượng huỳnh quang đó là:
·RDML (Ngôn ngữ đánh dấu dữ liệu PCR thời gian thực) – ngôn ngữ có cấu trúc và hướng dẫn báo cáo cho dữ liệu PCR định lượng thời gian thực;
·MIQE (Thông tin tối thiểu để xuất bản các thí nghiệm PCR định lượng thời gian thực) – thông tin tối thiểu để xuất bản các bài báo về các thí nghiệm PCR định lượng thời gian thực.
Đầu tiên, hãy nói về RDML, đặc tả thuật ngữ.

Nếu không có định nghĩa tiêu chuẩn cho mọi thứ, thì không thể tiếp tục thảo luận, đó là lý do tại sao việc giải thích các thuật ngữ rất quan trọng trong kỳ thi.
Thuật ngữ sử dụng trong thí nghiệm PCR định lượng huỳnh quang bao gồm nội dung sau.QIAGEN đã đưa ra bản tóm tắt tốt nhất cho chúng tôi.Sau đây là tất cả khôCác mặt hàng .

đường cong khuếch đại
Đường cong khuếch đại đề cập đến đường cong được tạo ra trong quá trình PCR, với số chu kỳ là trục hoành và cường độ huỳnh quang thời gian thực trong quá trình phản ứng là tọa độ.

Một đường cong khuếch đại tuyệt vời phải có các đặc điểm sau: đường cơ sở bằng phẳng hoặc giảm nhẹ và không có xu hướng tăng rõ ràng;điểm uốn của đường cong rõ ràng và độ dốc của pha hàm mũ tỷ lệ thuận với hiệu suất khuếch đại.Độ dốc càng lớn thì hiệu suất khuếch đại càng cao;đường cong khuếch đại tổng thể Độ song song tốt, cho thấy hiệu suất khuếch đại của mỗi ống là tương tự nhau;pha hàm mũ của đường cong khuếch đại của các mẫu có nồng độ thấp là hiển nhiên.

Đường cơ sở (Baseline)
Đường cơ sở là mức độ tiếng ồn của chu kỳ đầu, thường được đo giữa chu kỳ thứ 3 và thứ 15, vì không thể phát hiện được sự tăng giá trị huỳnh quang do sản phẩm khuếch đại gây ra trong giai đoạn này.Số lượng chu kỳ được sử dụng để tính toán đường cơ sở có thể thay đổi và có thể cần phải giảm nếu lượng khuôn mẫu được sử dụng cao hoặc nếu mức độ biểu hiện của gen mục tiêu cao.

Đặt đường cơ sở yêu cầu xem dữ liệu huỳnh quang từ đường cong khuếch đại tuyến tính.Đường cơ sở được đặt sao cho sự tăng trưởng của đường cong khuếch đại bắt đầu với số chu kỳ lớn hơn số đầu chu kỳ cơ sở.Đường cơ sở cần được đặt riêng cho từng chuỗi mục tiêu.Các giá trị huỳnh quang trung bình được phát hiện trong các chu kỳ đầu tiên cần được trừ khỏi các giá trị huỳnh quang thu được trong các sản phẩm được khuếch đại.Các phiên bản mới nhất của nhiều phần mềm PCR thời gian thực khác nhau cho phép tự động tối ưu hóa cài đặt đường cơ sở cho từng mẫu riêng lẻ.

Trong vài chu kỳ đầu tiên của phản ứng khuếch đại PCR, tín hiệu huỳnh quang không thay đổi nhiều.Tiếp cận một đường thẳng được gọi là đường cơ sở, nhưng nếu chúng ta xem xét kỹ một vài chu kỳ đầu tiên, chúng ta sẽ thấy rằng bên trong đường cơ sở là những gì đang xảy ra trong hình bên dưới.

Bối cảnh Bối cảnh đề cập đến
giá trị huỳnh quang không đặc hiệu trong phản ứng.Ví dụ: dập tắt huỳnh quang không hiệu quả;hoặc một số lượng lớn các mẫu DNA sợi đôi do sử dụng SYBR Green.Các thành phần nền của tín hiệu được loại bỏ toán học bằng thuật toán phần mềm Real-Time PCR.

Tín hiệu phóng viên
Tín hiệu báo cáo đề cập đến tín hiệu huỳnh quang được tạo bởi SYBR Green hoặc các đầu dò theo trình tự cụ thể được dán nhãn huỳnh quang trong PCR thời gian thực.

Tín hiệu báo cáo chuẩn hóa (RN)
RN đề cập đến cường độ huỳnh quang của thuốc nhuộm phóng viên chia cho cường độ huỳnh quang của thuốc nhuộm tham chiếu thụ động được đo ở mỗi chu kỳ.

Thuốc nhuộm tham chiếu thụ động
Trong một số PCR thời gian thực,thuốc nhuộm huỳnh quang ROX được sử dụng làm tham chiếu nội bộ để chuẩn hóa tín hiệu huỳnh quang.Nó hiệu chỉnh các biến thể do pipet không chính xác, vị trí giếng và dao động huỳnh quang trên cơ sở từng giếng.

Ngưỡng huỳnh quang (threshold)
đã được điều chỉnh trên giá trị nền và thấp hơn đáng kể so với giá trị cao nguyên của đường cong khuếch đại.Nó phải nằm trong vùng tuyến tính của đường cong khuếch đại, đại diện cho phạm vi phát hiện PCR log-tuyến tính.Các ngưỡng phải được đặt trong chế độ xem đường cong khuếch đại log để giai đoạn log-tuyến tính của PCR có thể dễ dàng xác định được.Nếu có nhiều gen mục tiêu trong Real-Time PCR, ngưỡng phải được đặt cho từng mục tiêu .Nói chung, tín hiệu huỳnh quang của 15 chu kỳ phản ứng PCR đầu tiên được sử dụng làm tín hiệu nền huỳnh quang và ngưỡng huỳnh quang gấp 10 lần độ lệch chuẩn của tín hiệu huỳnh quang của 3 đến 15 chu kỳ PCR đầu tiên và ngưỡng huỳnh quang được đặt trong giai đoạn khuếch đại PCR theo cấp số nhân.Nói chung, mỗi thiết bị đều có ngưỡng huỳnh quang được đặt trước khi sử dụng.

Ngưỡng chu kỳ (CT) hoặc Điểm giao nhau (CP)
Chu kỳ mà tại đó đường cong khuếch đại vượt qua ngưỡng (nghĩa là điểm mà tại đó khả năng phát hiện huỳnh quang tăng lên đáng kể).CT có thể là một phân số và số lượng mẫu ban đầu có thể được tính toán.Giá trị CT biểu thị số chu kỳ đã trải qua khi tín hiệu huỳnh quang trong mỗi ống phản ứng PCR đạt đến ngưỡng đã đặt.Có một mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị CT của mỗi mẫu và logarit của số lượng bản sao ban đầu của mẫu,số bản sao ban đầu càng cao, giá trị CT càng nhỏ và ngược lại.Có thể tạo một đường cong chuẩn bằng cách sử dụng một chuẩn có số bản sao ban đầu đã biết, trong đó trục hoành biểu thị giá trị CT và tung độ biểu thị logarit của số bản sao ban đầu.Do đó, miễn là thu được giá trị CT của mẫu chưa biết, số lượng bản sao ban đầu của mẫu có thể được tính từ đường cong chuẩn.

giá trị ΔCT
Giá trị ΔCT mô tảsự khác biệt giữa gen mục tiêu và giá trị CT của gen tham chiếu nội sinh tương ứng, chẳng hạn như gen giữ nhà và được sử dụng để bình thường hóa số lượng mẫu được sử dụng:
⇒ΔCT = CT (gen mục tiêu) – CT (gen tham chiếu nội sinh)

Giá trị ΔΔCT
Giá trị ΔΔCT mô tả sự khác biệt giữa giá trị ΔΔCT trung bình của một mẫu quan tâm (ví dụ: các ô được kích thích) và giá trị ΔΔCT trung bình của một mẫu tham chiếu (ví dụ: các ô chưa được kích thích).Mẫu tham chiếu còn được gọi là mẫu hiệu chuẩn và tất cả các mẫu khác được chuẩn hóa thành mẫu này để định lượng tương đối:
⇒ΔΔCT = ΔCT trung bình (mẫu quan tâm) – ΔCT trung bình (mẫu tham khảo)

Gen tham chiếu nội sinh (gen tham chiếu nội sinh)
Mức độ biểu hiện của các gen tham chiếu nội sinh, chẳng hạn như gen giữ nhà (housekeeper genes), không khác nhau giữa các mẫu.So sánh các giá trị CT của gen tham chiếu với gen mục tiêu cho phép mức biểu hiện của gen mục tiêu được chuẩn hóa thành lượng RNA hoặc cDNA đầu vào (xem phần về giá trị ΔCT ở trên).

Các gen tham chiếu bên trong chính xác chosự phân hủy RNA có thể xảy ra hoặc sự hiện diện của chất ức chế enzyme trong các mẫu RNA, cũng như sự thay đổi về hàm lượng RNA, hiệu quả phiên mã ngược, thu hồi axit nucleic và xử lý mẫu.Để chọn (các) gen tham chiếu tối ưu, chúng tôi đã sửa đổi thuật toán để cho phép lựa chọn tham chiếu tối ưu phụ thuộc vào cài đặt thử nghiệm.

Kiểm soát nội bộ
Trình tự đối chứng được khuếch đại trong cùng một phản ứng như trình tự đích và được thăm dò bằng một mẫu dò khác (nghĩa là thực hiện PCR song công).Các biện pháp kiểm soát nội bộ thường được sử dụng để loại trừ các trường hợp khuếch đại không thành công, chẳng hạn như khi không phát hiện được trình tự đích.
Mẫu hiệu chuẩn
Một mẫu tham chiếu (ví dụ: RNA tinh khiết từ một dòng tế bào hoặc mô) được sử dụng trong định lượng tương đối để so sánh tất cả các mẫu khác nhằm xác định mức biểu hiện tương đối của gen.Mẫu hiệu chuẩn có thể là bất kỳ mẫu nào, nhưng thường là mẫu đối chứng (ví dụ: mẫu chưa xử lý hoặc mẫu từ thời điểm 0 của thử nghiệm).

Kiểm soát tích cực
sử dụng các phản ứng kiểm soát vớilượng mẫu đã biết.Kiểm soát tích cực thường được sử dụng để kiểm tra xem bộ mồi hoặc bộ mồi-dò có hoạt động bình thường không và phản ứng có được thiết lập chính xác không.

Không kiểm soát mẫu (NTC)
Một phản ứng kiểm soát có chứa tất cả các thành phần cần thiết của phản ứng khuếch đại ngoại trừ khuôn mẫu, thường được thay thế bằng nước.Việc sử dụng NTC có thể tìm thấy sự nhiễm bẩn do nhiễm bẩn thuốc thử hoặc DNA ngoại lai, do đó đảm bảo tính xác thực và độ tin cậy của dữ liệu phát hiện.Sự khuếch đại của điều khiển NTC cho thấy sự nhiễm bẩn.

Không kiểm soát RT (NRT)
Quá trình tách RNA có thể chứa DNA genomic còn sót lại, cực kỳ có hại và là thủ phạm ảnh hưởng đến chất lượng dữ liệu và là thiên địch của qPCR nên khi thiết kế thí nghiệm phải thiết kế để chỉ khuếch đại phát hiện RNA.Có 2 cách, một là thiết kế primer ngang intron, hai là loại bỏ hoàn toàn DNA, cái nào tốt hơn sẽ nói sau.Bộ điều khiển NTR là một chiếc gương thần để phát hiện ô nhiễm DNA.Nếu có khuếch đại, có nghĩa là có ô nhiễm.

Tiêu chuẩn
Chất chuẩn là các mẫu có nồng độ hoặc số bản sao đã biết được dùng để dựng đường chuẩn.Để đảm bảo tính ổn định của tiêu chuẩn, đoạn gen thường được sao chép vào plasmid và được sử dụng làm tiêu chuẩn.

đường cong tiêu chuẩn
thường được pha loãng thành ít nhất 5 gradient nồng độ với sản phẩm chuẩn theo tỷ lệ nhân đôi và 5 điểm được vẽ theo tọa độ của giá trị CT và số bản sao, đồng thời các điểm được nối với nhau tạo thành một đường để tạo đường cong chuẩn.Đối với mỗi đường chuẩn, cần kiểm tra tính hợp lệ của nó.Giá trị độ dốc nằm trong khoảng từ –3,3 đến –3,8 và mỗi nồng độ được thực hiện ba lần.Các điểm khác biệt đáng kể so với các điểm khác nên bị loại bỏ.Giá trị CT của mẫu được kiểm tra được đưa vào đường cong tiêu chuẩn và có thể tính được mức độ biểu hiện của mẫu được kiểm tra.

Giá trị CT của mẫu cần kiểm tra được đưa vào đường chuẩn và có thể tính được số lượng bản sao ban đầu của mẫu cần kiểm tra.

Hiệu quả và Độ dốc
Độ dốc của đường chuẩn thể hiện hiệu quả của real-time PCR.
·Độ dốc -3,322 cho biết hiệu suất khuếch đại PCR là 1 hay hiệu suất 100% và lượng sản phẩm PCR tăng gấp đôi ở mỗi chu kỳ.
·Độ dốc nhỏ hơn –3,322 (ví dụ: –3,8) biểu thị hiệu quả PCR
·Độ dốc lớn hơn –3,322 (ví dụ: –3,0) cho thấy hiệu suất PCR dường như lớn hơn 100%. Điều này gây tò mò, làm thế nào một chu kỳ PCR có thể tạo ra nhiều hơn gấp đôi sản phẩm được khuếch đại?Tình trạng này xảy ra trong giai đoạn phi tuyến tính của phản ứng PCR, nghĩa là có một lượng lớn khuếch đại không đặc hiệu.

đường cong nóng chảy
Sau khi quá trình khuếch đại qPCR hoàn tất, sản phẩm PCR được gia nhiệt.Khi nhiệt độ tăng lên, sản phẩm khuếch đại sợi đôi dần dần tan chảy, dẫn đến cường độ huỳnh quang giảm.Khi đạt đến một nhiệt độ (Tm) nhất định, một lượng lớn sản phẩm sẽ bị nóng chảy.Huỳnh quang giảm mạnh.Các sản phẩm PCR khác nhau có giá trị Tm khác nhau và nhiệt độ nóng chảy khác nhau, do đó có thể xác định tính đặc hiệu của PCR.

Đường cong nóng chảy (đường cong phái sinh)
Đường cong nóng chảy được dẫn xuất để tạo thành một bản đồ đỉnh, có thể hiển thị trực quan hơn tình trạng của các đoạn sản phẩm PCR.Vì nhiệt độ nóng chảy là giá trị Tm của đoạn DNA, nên có thể đánh giá một số tham số ảnh hưởng đến giá trị Tm của đoạn DNA, chẳng hạn như kích thước đoạn, hàm lượng GC, v.v. Nói chung, theo nguyên tắc thiết kế mồi của chúng tôi,chiều dài của sản phẩm được khuếch đại nằm trong khoảng 80-300bp, vì vậy nhiệt độ nóng chảy phải nằm trong khoảng từ 80°C đến 90°C.

Giải thích đường cong nóng chảy: Nếu pic chính duy nhất xuất hiện trong khoảng 80°C-90°C, điều đó có nghĩa là PCR định lượng huỳnh quang là hoàn hảo;nếu đỉnh chính xuất hiện trong khoảng 80°C-90°C và các đỉnh phụ xuất hiện dưới 80°C, thì về cơ bản, bộ điều chỉnh độ sáng của mồi được xem xét.Bạn có thể thử tăng nhiệt độ ủ để giải quyết;nếu đỉnh chính xuất hiện trong khoảng từ 80°C-90°C và đỉnh phụ xuất hiện trở lại khi nhiệt độ tăng lên, thì về cơ bản được coi là có sự nhiễm bẩn DNA và DNA cần được loại bỏ ở giai đoạn đầu của thí nghiệm.

Tất nhiên, vẫn còn một số tình huống bất thường, sẽ được chia nhỏ từng trường hợp bên dưới.
3. Kiến thức nâng cao

Để thực hiện qPCR, tôi phải nói MIQE,Thông tin tối thiểuđể xuất bảnĐịnh lượngPCR thời gian thựcThí nghiệm — thông tin tối thiểu để xuất bản các bài báo về PCR định lượng thời gian thựcthí nghiệm .Để đơn giản hóa sự hiểu biết của mọi người, chúng tôi sẽ đơn giản hóa nội dung chính.

Bạn có thể tìm kiếm văn bản gốc của MIQE trên Internet và điều quan trọng nhất là nó quy địnhdanh sách kiểm tra dữ liệu cần được cung cấp khi xuất bản một bài báo .

Người đánh giá có thể đánh giá chất lượng của thử nghiệm bằng cách đọc các chi tiết này;độc giả trong tương lai cũng có thể sử dụng điều này để lặp lại hoặc cải thiện thử nghiệm.
Điều đáng chú ý là trong danh sách này, mức độ quan trọng của từng danh sách được đánh dấu bằng E hoặc D tương ứng.Nó có nghĩa là gì?E: thông tin cần thiết (phải được gửi);D: thông tin mong muốn (cung cấp càng nhiều càng tốt).

MIQE (1)—Thiết kế thử nghiệm
Nhiều kẻ đê tiện sau khi học xong cao học bảo vệ xong sẽ không biết cách độc lập thiết kế thí nghiệm, mở vở ra và làm theo lời thầy.Kết quả là, thiết kế thử nghiệm không chặt chẽ, và bộ phận biên tập của tạp chí nói rằng họ muốn tạo ra bức tranh này và bức tranh kia, vì vậy họ đã làm điều đó một cách bàng hoàng.Đây là cách những kẻ lừa đảo được tạo ra!

Gần nhà hơn, nguyên tắc đầu tiên của thí nghiệm là xác địnhsự chặt chẽ của logic thực nghiệm.Điều cơ bản nhất là thiết kế thử nghiệm và điều quan trọng nhất của thiết kế thử nghiệm là cách đặt mẫu đích, mẫu tham chiếu (đối chứng) và số lần lặp lại để dữ liệu thử nghiệm có thể được tham khảo, so sánh và thuyết phục.

mẫu mục tiêuđề cập đến mẫu yêu cầu chúng tôi phát hiện gen mục tiêu sau một quá trình xử lý nhất định.mẫu tham khảolà mẫu không có bất kỳ xử lý nào, thường được gọi là loại hoang dã trong sinh học.

sao chép thử nghiệmthì rất quan trọng.Nói chung, số lượng bản sao thuyết phục phải nhiều hơn ba.Cần phân biệt thế nào là nhân bản sinh học và thế nào là nhân bản kỹ thuật.

sao chép sinh học: Cùng một thí nghiệm kiểm chứng được thực hiện với các vật liệu khác nhau (thời gian, thực vật, lô, đĩa phản ứng).

sao chép sinh học
Hãy lấy việc xử lý hồ tiêu bằng thuốc trừ sâu làm ví dụ.Chúng tôi muốn phun thuốc trừ sâu lên ba cây ABC, sau đó ba cây ABC là ba bản sao sinh học và chúng là cùng một thí nghiệm xác minh được thực hiện với các vật liệu khác nhau.Nhưng đã là thí nghiệm thì chắc chắn cần có biện pháp đối chứng, vì vậy chúng ta có thể phun một trong các nhánh của cây A để tạo thành nhóm thực nghiệm của cây A chứ không phun các nhánh khác của cây A để tạo thành nhóm đối chứng.Làm tương tự cho B và C.

Bản sao kỹ thuật (Technical Replicates): Đây là một thử nghiệm lặp đi lặp lại được thiết kế để tránh các lỗi do vận hành gây ra, đây thực sự là một lỗ trùng lặp được bao gồm trong cùng một vật liệu.Cả phương pháp điều trị và đối chứng đều phải có cài đặt sao chép (tối thiểu ba) của gen mục tiêu và gen tham chiếu nội bộ.

Kỹ thuật lặp lại
Lại lấy hạt tiêu được xử lý bằng thuốc trừ sâu làm ví dụ.Đối với nhóm thực vật A thử nghiệm, chúng tôi đã tạo ba lỗ PCR tương ứng là 1, 2 và 3 cho gen mục tiêu và gen tham chiếu bên trong của nó, để lấy giá trị trung bình sau khi phát hiện.Đối với việc kiểm soát thực vật Nhóm A cũng được xử lý theo cách tương tự.Tương tự, xử lý như vậy đối với cây B và cây C.Đây là sự lặp lại kỹ thuật.

Điều đáng chú ý lànhững gì đưa vào thống kê là sự lặp lại sinh học, và sự lặp lại kỹ thuật là để kiểm tra xem có bất kỳ hiện tượng ngẫu nhiên nào trong quá trình thí nghiệm hay không, để làm cho kết quả thí nghiệm trở nên đáng tin cậy, tức là tránh sai số bằng cách lấy trung bình của chúng như chúng ta thường nói.

Biện pháp Kiểm soát Tiêu cực—NTC và NRT
NTC (Kiểm soát không có mẫu), một điều khiển không có mẫu, được sử dụng để xác minh xem vật liệu thí nghiệm có bị nhiễm bẩn hay không.Nói chung, nước được sử dụng làm mẫu.Nếu có phản ứng huỳnh quang, chứng tỏ phòng thí nghiệm đã xảy ra nhiễm axit nucleic.

Những ô nhiễm này đến từ: nước không tinh khiết, thuốc thử không đủ tiêu chuẩn chứa DNA nội sinh, ô nhiễm mồi, ô nhiễm thiết bị phòng thí nghiệm, ô nhiễm sol khí, v.v., cần sử dụng chất tẩy RNase và chất ức chế RNase.Ô nhiễm sol khí là khó phát hiện nhất.Hãy tưởng tượng phòng thí nghiệm của bạn giống như sương khói, với nhiều loại axit nucleic lơ lửng trong không khí.

NRT (No-Reverse Transcriptase), đối chứng không phiên mã ngược, là ARN không được phiên mã ngược là đối chứng âm, là đối chứng dư lượng gDNA.

Khi thực hiện biểu hiện gen, lượng RNA được phát hiện bằng cách phát hiện lượng cDNA sau phiên mã ngược.Nếu có dư lượng gDNA khi RNA được tinh chế, nó sẽ gây ra sai số trong kết quả thí nghiệm, vì kết quả thực tế thu được là gDNA và cDNA.Ở cấp độ tổng hợp, không chỉ cDNA, gDNA cần được loại bỏ hoàn toàn trong quá trình chiết xuất RNA.

MIQE (2)—thông tin mẫu
Cái gọi là thông tin mẫu có nghĩa là khi chúng tôi đăng một bài báo về qPCR, chúng tôi phải giải thích rõ ràng về thông tin mẫu, đây là một phần không thể thiếu của bài báo.Tương tự, khi chúng tôi xử lý mẫu, chúng tôi cũng phải tự điều chỉnh hoạt động của mình để đảm bảo tính hợp lệ của mẫu.

Mô tả của mẫu chỉ là kết quả và chúng ta nên chú ý nhiều hơn đến các tài liệu được thực hiện trong toàn bộ thí nghiệm.

Lựa chọn vật liệu thí nghiệm
Mẫu máu – chọn máu tươi, không quá 4 giờ.Mẫu tế bào – chọn thu thập các tế bào tươi trong thời kỳ tăng trưởng mạnh mẽ.Mô động vật—Chọn mô tươi, phát triển mạnh.Mô thực vật – Chọn mô tươi, non.

Bạn hẳn đã nhận thấy rằng có một từ khóa trong vài câu này: tươi.
Đối với các mẫu trên, bộ tốt nhất, hiệu quả về chi phí và ổn định trên thị trường là bộ của Foregene, có thể trích xuất DNA và RNA của chúng một cách nhanh chóng và dễ dàng.

Bộ dụng cụ mini DNA máu

Bộ phân lập RNA tổng số tế bào

Bộ phân lập RNA tổng số động vật

Bộ phân lập RNA tổng số thực vật

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Bộ phân lập DNA thực vật

Lưu trữ vật liệu thí nghiệm
Nói chung, chúng tôi không khuyên bạn nên lưu trữ mẫu nếu điều kiện cho phép.Tuy nhiên, có nhiều bạn không thể tiến hành thí nghiệm ngay sau khi lấy mẫu, thậm chí có bạn còn phải vác bình nito lỏng ra hiện trường lấy mẫu.

Đối với loại bạn chăm chỉ này, tôi chỉ có thể nói rằng bạn không hiểu vật tư tiêu hao thuốc thử.Hiện nay, nhiều công ty tiêu thụ thuốc thử sản xuất thuốc thử có thể lưu trữ mẫu RNA ở nhiệt độ phòng và bạn có thể chọn sử dụng chúng.Phương pháp lưu trữ thông thường là lưu trữ nitơ lỏng, sử dụng bình chứa nitơ lỏng nhỏ dễ mang theo.Sau khi mang mẫu về phòng xét nghiệm, bảo quản trong tủ lạnh -80°C.

Đối với các thí nghiệm liên quan đến RNA, nguyên tắc sáu từ phải được tuân theo:nhiệt độ thấp, không có enzyme,Vànhanh .

Khái niệm nhiệt độ thấp rất dễ hiểu;không có enzyme thì RNase có ở khắp mọi nơi trên thế giới chúng ta đang sống (nếu không bạn đã bị HIV giết chết), vì vậy làm thế nào để tránh RNase khi làm thí nghiệm là một khái niệm rất quan trọng;nhanh,Trên đời không có võ công nào là không thể công phá, chỉ có tốc độ là không thể công phá.

Do đó, theo một nghĩa nào đó, thời gian chiết xuất càng ngắn thì bộ dụng cụ càng tốt.Tại saotiền thânbộ nhấn mạnh tốc độ, bởi vì họ biết rõ về nó.

Tái bút: Có cô gái làm thí nghiệm rất cẩn thận, nhưng làm mấy năm cũng không bằng một cái slam dunk.Họ cảm thấy Chúa không công bằng, phàn nàn về người khác và tìm kiếm cuộc sống.Thực ra cô cũng không hiểu.Anh ấy đã không bảo vệ tốt RNA và người chơi slam dunk rất nhanh nhẹn.Khi thực hiện thí nghiệm, anh ấy nghĩ rằng mình sẽ hoàn thành cú đánh bóng với ba lần, năm lần và hai lần chia, nhưng anh ấy đã thực hiện tốt thí nghiệm.

Ghi chú: Chậm hơn, nhiều cơ hội bị RNase xâm nhập hơn.Làm thế nào để đào tạo bản thân để được nhanh chóng?Không có cách nào, chỉ cần thực hành nhiều hơn.

Đối với các thí nghiệm khác nhau và các mẫu khác nhau, vẫn cần phải đọc thêm tài liệu và chọn một phương pháp thích hợp để xử lý.Đối với quy trình thu thập và lưu trữ mẫu, MIQE yêu cầu phải ghi rõ ràng trên giấy, để người đánh giá có thể xem xét độ tin cậy của bài báo, đồng thời cũng thuận tiện cho các bạn nhỏ còn bỡ ngỡ lặp lại thí nghiệm của mình.

Thí nghiệm sinh học mặc dù khó, nhưng là cao cấp.Nếu bạn không cẩn thận, bạn có thể lật ngược thế giới.Ví dụ như biến SARS thành khủng hoảng sinh hóa, hay tạo ra giống lúa lai để cứu 1,3 tỷ người.Hình ảnh bên dưới là một thí nghiệm hóa học, chỉ cần nhìn vào vẻ ngoài giống tinh ranh của anh ấy là bạn sẽ hiểu bạn tự hào về nghiên cứu của mình như thế nào.Quên đi, đừng bôi đen anh ấy.

MIQE (3) – chiết xuất axit nucleic.
Chiết xuất axit nucleic là một sự kiện lớn và tất cả các thí nghiệm sinh học phân tử đều bắt đầu bằng chiết xuất axit nucleic.Trước hết, hãy sao chép nội dung của MIQE về chiết xuất axit nucleic.

Nhìn vào bộ dạng này, bạn không thể ở trên bề mặt.Hình thức là một giáo điều.Để trở thành một sinh viên hàng đầu, bạn phải hỏi tại sao.Nội dung cốt yếu của bảng này là: Theo đuổiđộ tinh khiết, tính toàn vẹn, tính nhất quán và lượng chiết xuất của RNA .

Phần đầu tiên củaquy trình hoặc dụng cụ là bước chiết xuất axit nucleic.Nếu bạn sử dụng máy chiết xuất axit nucleic tự động để chiết xuất (cao cấp, vui lòng liên hệ với tôi để mua), bạn cần cho biết tên kiểu máy của thiết bị.

Tên của bộ và

bộ dụng cụ nào đã được sử dụng để thay đổi chi tiết, thuốc thử đặc biệt nào đã được thêm vào hoặc những thao tác đặc biệt nào đã được thực hiện phải được giải thích rõ ràng để những người khác có thể dễ dàng lặp lại thí nghiệm của bạn.

Một số người thêm một số thuốc thử đặc biệt khi chiết xuất các mẫu đặc biệt, nghĩ rằng đây là vũ khí bí mật của họ và không nói cho người khác biết.Trong khi giữ bí mật, họ cũng đánh mất cơ hội làm cho bài viết của bạn tỏa sáng.Đừng thông minh, bạn phải trung thực hơn Zhang lão làng trong nghiên cứu khoa học, nếu bạn muốn thông minh, bài báo sẽ khiến bạn trở nên ngu ngốc.

phải nhớ số sản phẩm của bộkhi bạn đặt mua bộ tài liệu và viết bài.Thường có hai con số trên bộ sản phẩm: Cat—số danh mục (số sản phẩm, số mặt hàng), Lô—số lô sản phẩm ( Được sử dụng để cho biết sản phẩm đến từ lô nào).

Ngoài ra, số CAS thường được sử dụng khi đặt hàng thuốc thử sinh hóa, và tôi sẽ phổ biến nó cùng nhau.Số CAS là số do Hiệp hội Hóa học Hoa Kỳ đưa ra cho mỗi loại thuốc hóa học mới.Nói chung, ba số được kết nối bởi một dấu gạch ngang.Số CAS của Rushui: 7732-18-5.Hóa chất thường có nhiều bí danh, nhưng số CAS là duy nhất.Khi đặt mua thuốc, bạn có thể kiểm tra số CAS của nó trước.

Gần nhà hơn, tại sao chúng ta phải mô tả rõ ràng những điều này?Trên thực tế, nó cũng là để kiểm tra chất lượng chiết xuất RNA.Việc sử dụng các dụng cụ và bộ dụng cụ sẽ giúp quá trình trích xuất RNA trở nên nhất quán hơn.Quy mô khai thác của các phòng thí nghiệm thông thường không lớn và có thể thu được bằng bộ dụng cụ.

Chi tiết về xử lý DNase hoặc RNase
Vấn đề quan trọng của PCR định lượng huỳnh quang là ngăn ngừa nhiễm bẩn DNA và không thử nghiệm nếu có nhiễm bẩn.Do đó, bắt buộc phải nêu rõ quy trình bạn đã sử dụng để xử lý DNA, nhằm chứng minh rằng DNA trong quá trình thí nghiệm đã được loại bỏ hoàn toàn và toàn bộ.được biểu diễn bằng giản đồ.

Sơ đồ RNA và DNA
Nói chung, phương pháp loại bỏ DNA là xử lý RNA bằng DNase sau khi chiết xuất.Tuy nhiên, đây là những phương pháp tương đối cũ.Các bộ tách chiết RNA thương mại có thể loại bỏ DNA trong quá trình chiết xuất mà không cần thêm DNase.Ví dụ: một loạt bộ dụng cụ từ Foregene.

Ghi chú: Loại bỏ DNA trong quá trình tách chiết RNA là con dao hai lưỡi rất nguy hiểm, sẽ kéo dài thời gian thao tác tách chiết RNA và tăng nguy cơ phân hủy RNA.Về cơ bản, đó là sự đánh đổi giữa năng suất RNA và độ tinh khiết.

Ngoài ra, lượng DNase được thêm vào cột hấp phụ dựa trên silica là rất nhỏ và phải sử dụng DNase chất lượng cao để đạt được hiệu quả.DNase không được tối ưu hóa không thể được tiêu hóa nhanh chóng và hoàn toàn.Đây là một bài kiểm tra trình độ kỹ thuật của thương nhân.Tất nhiên, có những thương gia kỳ quặc hơn còn khoe khoang rằng có thể loại bỏ DNA mà không cần DNase.Có thể nói ai khoe khoang có thể loại bỏ hoàn toàn DNA mà không cần DNase đều là côn đồ.DNA là một cấu trúc sợi kép tương đối ổn định và nó không thể bị xóa sổ chỉ bằng cách nói và cười.

đánh giá ô nhiễm
phương pháp đánh giá: phát hiện điện di, 1% agarose, 6V/cm, 15 phút, tải 1-3 ul

phân tích định lượng axit nucleic
thường được đo bằng máy quang phổ UV.Trước tiên tôi xin phổ biến ý nghĩa của ba giá trị OD260, OD280 và OD230.
·OD260nm: Là bước sóng hấp thụ của đỉnh hấp thụ cao nhất của axit nucleic và giá trị đo được tốt nhất nằm trong khoảng từ 0,1 đến 1,0.Nếu không, pha loãng hoặc cô đặc mẫu để đưa mẫu về phạm vi cho phép.
·OD280nm: Là bước sóng hấp thụ của đỉnh hấp thụ cao nhất của protein và các chất phenolic.
·OD230nm: Là bước sóng hấp thụ của đỉnh hấp thụ cao nhất của cacbohydrat.

Tiếp theo, hãy nói về vai trò của từng chỉ số.Đối với A260, nó có thể được sử dụng để đo năng suất axit nucleic.Khi OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Về độ tinh khiết, chúng ta cần xem xét các tỷ lệ mà chúng ta thường thấy: OD260/280 và OD260/230.
·ADN tinh khiết: OD260/280 xấp xỉ bằng 1,8.Khi nó lớn hơn 1,9, nó chỉ ra rằng có sự ô nhiễm RNA và khi nó nhỏ hơn 1,6, nó cho thấy rằng có sự ô nhiễm protein và phenol.
·ARN tinh khiết: 1,7
·OD260/230: Dù là DNA hay RNA, giá trị tham chiếu là 2,5.Khi nó nhỏ hơn 2,0, nó chỉ ra rằng có ô nhiễm đường, muối và chất hữu cơ.

tính toàn vẹn của RNA

Điều rất quan trọng là đo tính toàn vẹn của RNA.Nói chung, cần thực hiện thí nghiệm gel biến tính RNA để kiểm tra xem độ sáng giữa RNA 28S và 18S có phải là mối quan hệ hai chiều hay không.Khi dải thứ ba 5S xuất hiện, điều đó có nghĩa là RNA đã bắt đầu thoái hóa, ngoại trừ động vật không xương sống.

Dữ liệu đánh giá chất lượng RNA: Ngoài các xét nghiệm trên, còn có một số xét nghiệm bằng thiết bị cao cấp hơn về tính toàn vẹn của RNA, chẳng hạn như xét nghiệm tính toàn vẹn RQI của hệ thống điện di tự động Experion, có thể phát hiện RNA có bị phân hủy một cách vô hình hay không.

Trong nghiên cứu khoa học, PCR định lượng huỳnh quang là phép so sánh giữa gen mục tiêu và gen tham chiếu bên trong.Do đó, trong quá trình bảo quản mẫu RNA, chiết xuất RNA, v.v., mục tiêu hàng đầu là đảm bảo tính toàn vẹn của RNA.

Có thể dễ dàng hiểu được tính toàn vẹn của RNA ảnh hưởng đến sự cân bằng giữa gen mục tiêu và gen tham chiếu bên trong như thế nào từ hình bên dưới.Sự xuống cấp sẽ dẫn đến sự không hoàn chỉnh của gen, cho dù đó là sự không hoàn chỉnh của gen tham chiếu bên trong hay sự không hoàn chỉnh của gen mục tiêu, nó sẽ có tác động lớn đến dữ liệu.

Sơ đồ của gen mục tiêu và gen tham chiếu, không được đúng

Thử nghiệm ức chế (liệu giá trị CT có bị ức chế ở nồng độ cao hay thấp hoặc các điều kiện khác)

Lấy hình này làm ví dụ, các giá trị Ct của năm đường cong như sau.Sự phân bố giá trị CT giữa các đường cong không đồng đều và giá trị Ct bị trễ ở nồng độ cao và thấp, đây là trường hợp ức chế PCR.

Điểm mấu chốt: Trong quá trình tách chiết RNA, chúng ta cần bỏ quan niệm sai lầm và thiết lập quan điểm đúng.

Quan điểm sai lầm là: tách chiết RNA chỉ chạy theo sản lượng, nghĩ rằng lượng RNA thu được càng lớn càng tốt.Trên thực tế, khi chúng ta định lượng, nếu số lượng gen không lớn lắm, chúng ta không cần nhiều RNA.Lượng RNA bạn trích xuất là quá đủ.

Khái niệm đúng là:Chiết xuất RNA nên theo đuổi độ tinh khiết, tính toàn vẹn và tính nhất quán.Độ tinh khiết có thể đảm bảo rằng quá trình sao chép ngược sau đó không bị ức chế và dữ liệu sẽ không bị ảnh hưởng bởi DNA.Tính toàn vẹn đảm bảo sự cân bằng của trình tự mục tiêu và tham chiếu nội bộ.Tính nhất quán đảm bảo tải mẫu ổn định.

MIQE (4) – sao chép ngược
quan niệm sai lầm: theo đuổi khối lượng mẫu cao hơn.
quan niệm đúng: Theo đuổi tính nhất quán (ổn định), bất kể lượng RNA được nạp vào là bao nhiêu, hiệu quả của phiên mã ngược vẫn nhất quán, đảm bảo rằng sự khác biệt trong cDNA có thể phản ánh đúng sự khác biệt trong mRNA.
Chúng tôi giải thích quá trình này bằng một sơ đồ:

Sơ đồ hiệu suất phiên mã ngược, không đúng
Trước hết, chúng ta cần hiểu sự khác biệt giữa quá trình sao chép ngược và quá trình PCR.PCR trải qua nhiều quá trình gia nhiệt và ủ, và đoạn mục tiêu phát triển theo cấp số nhân;trong khi phiên mã ngược không có quá trình này, chúng ta có thể tưởng tượng rằng phiên mã ngược thực sự là một-đối-một. Trong quá trình sao chép, nhiều đoạn RNA

vì có thể nhận được bao nhiêu phần Thông tin cDNA, nên bây giờ bạn nên hiểu điều đó, bởi vì các đoạn lớn và nhỏ đã được sao chép ngược và không thể tập trung vào một đoạn.Và do lượng RNA tương đối ít nên lượng cDNA thu được cũng tương đối ít, không giống như PCR, có tác dụng khuếch đại nên về cơ bản là không thể phát hiện được.

kết quả điện di cDNA
Thứ hai, lý tưởng nhất là sao chép ngược được thực hiện một đối một, nhưng không có phiên mã ngược nào từ bất kỳ công ty nào có thể đạt được hiệu quả này.Về cơ bản, hiệu quả của hầu hết các phiên mã ngược dao động trong khoảng 30-50%.Nếu đúng như vậy, chúng ta thà có hiệu suất phiên mã ngược tương đối ổn định, đó là những gì chúng ta muốn thấy trong hình: 3 RNA nhận 2 cDNA, 6 RNA nhận 4 cDNA, do đó, cho dù có tải bao nhiêu mẫu, hiệu suất sao chép ngược cũng tương đối ổn định.Chúng tôi không muốn thấy tình huống hiệu suất phiên mã ngược không ổn định và nồng độ cao bị ức chế.

Vậy làm thế nào để kiểm chứng hiệu quả phiên mã ngược có ổn định hay không?Phương pháp này rất đơn giản, bạn chỉ cần làm một phép thử so sánh: một là sao chép ngược thành cDNA sau khi pha loãng RNA gấp đôi, hai là thực hiện sao chép ngược thành cDNA sau khi pha loãng gấp đôi, sau đó thực hiện qPCR để xem độ dốc thu được có nhất quán không.Là một sinh viên hàng đầu, bạn nên hiểu nó trong vài giây.Như hình dưới đây:

Pha loãng RNA và cDNA để kiểm tra xem hiệu quả của phiên mã ngược có ổn định không
Phiên mã ngược và kit
Làm thế nào có thể hoàn thiện PCR định lượng huỳnh quang có phiên mã ngược và kit tuyệt vời.Phiên mã ngược được chia thành hai loại theo nguồn, AMV hoặcM-MLVvà hiệu suất của chúng giống như trong bảng.

Hoạt động của RNase H
RNase H là Ribonuclease H, tên tiếng Trung là ribonuclease H, là một endoribonuclease có thể thủy phân đặc hiệu RNA trong chuỗi lai DNA-RNA.RNase H không thể thủy phân các liên kết phosphodiester trong DNA hoặc RNA sợi đơn hoặc sợi kép, nghĩa là nó không thể tiêu hóa DNA hoặc RNA sợi đơn hoặc sợi kép.Thường được sử dụng trong quá trình tổng hợp sợi thứ hai của cDNA.

Đó là một điều kỳ lạ.Chúng tôi nói rằng enzyme sao chép ngược có hoạt động RNase H, không phải là enzyme sao chép ngược có chứa RNase H và có thể không tách được RNase H khỏi enzyme sao chép ngược, có lẽ do cấu tạo của một số nhóm nhất định trong enzyme sao chép ngược mà hoạt động này là do enzyme sao chép ngược gây ra.

Do đó, bất kể hiệu quả phiên mã ngược của AMV cao hơn, hoạt động RNase H của nó làm giảm sản lượng của cDNA.Tất nhiên, các nhà sản xuất thuốc thử liên tục tối ưu hóa sản phẩm của họ để loại bỏ hoạt động RNase H trong phiên mã ngược càng nhiều càng tốt nhằm tăng sản lượng cDNA.
nhiệt độ ủ

Cấu trúc bậc hai của RNA ở các nhiệt độ khác nhau
Xem hình trên để biết cấu trúc thứ cấp của RNA ở các nhiệt độ khác nhau và sử dụng công cụ trực tuyến mFold để xác định cấu trúc thứ cấp của đoạn mục tiêu trong các điều kiện nhiệt độ và nồng độ muối cụ thể.Ở 55°C, cấu trúc bậc hai của RNA vẫn rất phức tạp, enzyme phiên mã ngược không thể hoạt động và cấu trúc bậc hai không thể được phân giải hoàn toàn cho đến 65°C, trong khi nhiệt độ tối ưu của AMV và M-MLV lại thấp hơn nhiều so với nhiệt độ này.
phải làm gì?Cấu trúc thứ cấp là sự bắt cặp bổ sung của chính khuôn mẫu, dẫn đến sự cạnh tranh mạnh mẽ giữa đoạn mồi và phiên mã ngược với khuôn mẫu, dẫn đến một loạt vấn đề như E thấp và độ lặp lại kém.

phải làm gì?Chỉ tăng nhiệt độ ủ càng nhiều càng tốt.

Nhiều nhà sản xuất thuốc thử đang cải tiến enzyme phiên mã ngược của họ thông qua kỹ thuật di truyền.Một số làm tăng nhiệt độ phản ứng, chẳng hạn như Jifan và Aidelai, và một số loại bỏ nhóm hoạt động của enzyme RNase H để cải thiện ái lực giữa enzyme và mẫu RNA.Ái lực cao có thể loại bỏ cấu trúc thứ cấp một cách cạnh tranh và đọc trơn tru, đồng thời cũng cải thiện đáng kể hiệu quả của phiên mã ngược.
Điểm mấu chốt: Phiên mã ngược để theo đuổi tính nhất quán của hiệu quả phiên mã ngược (enzym không chỉ hiệu quả mà còn phải ổn định) quan trọng hơn là lượng mẫu được nạp, nếu không phải là PCR định lượng huỳnh quang quy mô lớn, thì hoàn toàn không thể thực hiện được.Nhiều cDNA.
Nhiều nhà sản xuất cũng đã thực hiện một số nỗ lực trong việc theo đuổi tính nhất quán.Ví dụ, hầu hết các công ty hiện nay đã đóng gói phiên mã ngược thành một bộ tiêu chuẩn để bán, đây là một lựa chọn tốt.
Ví dụ: bộ dụng cụ RT Easy Series của Foregene:

RT Easy I (Hỗn hợp chính cho bộ tổng hợp cDNA sợi đầu tiên)

MIQE (5) – thông tin gen mục tiêu

Hình trên giải thích
1. Nói chung, gen này có hiệu quả đối với các thí nghiệm lặp đi lặp lại hay không có thể được xác minh bằng các thí nghiệm lặp đi lặp lại.
2. ID gen, bạn biết đấy.
3. Chiều dài gen, tổng chiều dài của gen mục tiêu chắc chắn không có vấn đề gì.Khi thiết kế đoạn mồi, đảm bảo rằng độ dài của bộ khuếch đại nằm trong khoảng 80-200bp để đảm bảo hiệu quả khuếch đại tốt hơn.
4. Thông tin so sánh trình tự Blast, gen mục tiêu cần được so sánh trong ngân hàng gen để tránh hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu.
5. Sự hiện diện của gen giả.Gene giả là một chuỗi DNA tương tự như gen bình thường nhưng mất đi chức năng bình thường.Nó thường tồn tại trong họ đa gen của sinh vật nhân thực.Nó thường được đại diện bởi ψ.Nó là một bản sao DNA bộ gen không có chức năng trong bộ gen rất giống với trình tự gen mã hóa., thường không được phiên mã và không có ý nghĩa sinh lý rõ ràng.
6. Vị trí của đoạn mồi so với exon và intron.Trong những năm đầu, khi chúng tôi giải quyết vấn đề nhiễm DNA, chúng tôi thường chú ý đến vị trí của mồi, exon và intron và thường xem xét việc thiết kế mồi ngang qua intron để tránh khuếch đại DNA.Vui lòng xem hình bên dưới: màu đen đại diện cho intron, các màu xanh khác nhau đại diện cho exon, màu hồng đại diện cho các đoạn mồi phổ biến và màu đỏ tươi tượng trưng cho các đoạn mồi kéo dài intron.

Sơ đồ, không bao giờ đúng
Đây có vẻ là một kế hoạch hoàn hảo, nhưng trên thực tế, trong hầu hết các trường hợp, đoạn mồi trans-intron không kỳ diệu như tưởng tượng, và chúng cũng sẽ gây ra sự khuếch đại không đặc hiệu.Vì vậy, cách tốt nhất để ngăn ngừa ô nhiễm DNA là loại bỏ hoàn toàn DNA.
7. Dự đoán cấu hình.Sử dụng lại ví dụ này, sử dụng công cụ trực tuyến mFold để xác định cấu trúc thứ cấp của đoạn mục tiêu ở nhiệt độ và nồng độ muối cụ thể.

Cấu trúc bậc hai của RNA ở các nhiệt độ khác nhau
Cấu trúc thứ cấp là sự ghép nối bổ sung của chính mẫu, điều này sẽ dẫn đến sự cạnh tranh mạnh mẽ giữa cặp mồi và mẫu, và khả năng liên kết của mồi ít hơn, dẫn đến một loạt vấn đề như E thấp và độ lặp lại kém.Thông qua phần mềm dự đoán, nếu không có vấn đề về cấu trúc thứ cấp thì thật tuyệt.Nếu có, bài viết tiếp theo của chúng tôi sẽ thảo luận cụ thể về cách giải quyết vấn đề này.

MIQE (6)—qPCR Oligonucleotide

Đối với PCR định lượng huỳnh quang, điều đầu tiên bạn phải vật lộn hàng ngày là tách chiết RNA, và điều thứ hai có thể là thiết kế mồi.
Trước hết, chúng ta vẫn kiểm tra các quy định về thiết kế sơn lót theo MIQE checklist.Nó đơn giản đến mức những kẻ đê tiện cũng có thể bật cười, và chúng ta có thể hoàn thành nó trong một câu: tìm ra trình tự và vị trí của đầu dò mồi và phương pháp sửa đổi.Đối với phương pháp tinh chế mồi, hiện tại quá trình tổng hợp mồi rất rẻ, qPCR xứng đáng với các phương pháp tinh chế PAGE trở lên và thông tin của công cụ tổng hợp không quan trọng.Nhiều người đã làm mồi trong nhiều thập kỷ và không biết rằng bộ tổng hợp là ABI3900.
Về nguyên tắc thiết kế primer, bạn không cần phải học thuộc lòng, vì hầu hết các phần mềm thiết kế primer hoặc công cụ trực tuyến đều có thể giải quyết những vấn đề này (công cụ trực tuyến khuyên dùng primer3.ut.ee/), và 99,999% thiết kế primer không được thực hiện thủ công. Nhìn tác giả có khi thiết kế hàng trăm primer một ngày, đọc từng cái một sẽ hoa cả mắt.
Chỉ cần kiểm tra các điểm sau sau khi mồi được thiết kế:
1. Thiết kế các đoạn mồi gần với đầu 3′: Trong trường hợp sử dụng các đoạn mồi oligo dT để tổng hợp chuỗi đầu tiên của cDNA, xét đến hiệu quả phiên mã ngược và tính toàn vẹn của RNA, các đoạn mồi được thiết kế cần được thiết kế gần với đầu 3′ để cải thiện hiệu quả khuếch đại.Sử dụng một hình ảnh để giải thích như sau (không có cách nào để hiểu điều này):

Tại sao mồi phải thiết kế sát đầu 3′, chắc không đúng
2. Giá trị TM: Giá trị Tm ở 55-65°C (vì hoạt động exonuclease cao nhất ở 60°C) và hàm lượng GC ở mức 40% -60%.
3. BLAST: Để tránh sự khuếch đại không đặc hiệu của bộ gen, Blast phải được sử dụng để xác minh bổ sung.

MIQE(7)—quy trình qPCR

1. bộ qPCR
Theo yêu cầu của MIQE, chúng tôi phải mô tả rõ ràng đầy đủ các điều kiện phản ứng trong bài viết, bao gồm cấu hình hệ thống phản ứng PCR, sử dụng kit gì, nhà sản xuất là ai, quy mô hệ thống phản ứng như thế nào, sử dụng phương pháp nhuộm hay phương pháp dò, cài đặt chương trình PCR.Những người lái xe kỳ cựu chắc chắn sẽ thấy rằng miễn là bộ này được chọn, thông tin trên về cơ bản đã được xác định.
Hiện nay, việc chế tạo và sản xuất bộ dụng cụ PCR định lượng huỳnh quang là một công nghệ rất trưởng thành.Miễn là bạn không chọn những nhà sản xuất cực kỳ tồi thì khả năng xảy ra sự cố là không cao, nhưng chúng tôi vẫn muốn chia sẻ với bạn một vài điểm:
Enzyme Taq khởi động nóng:Phần quan trọng nhất của PCR là enzyme Taq khởi động nóng.Các enzyme khởi động nóng trên thị trường thường được chia thành hai loại, một loại là enzyme khởi động nóng được biến đổi về mặt hóa học (bạn có thể tưởng tượng nó giống như nhúng parafin), và loại còn lại là enzyme khởi động nóng để biến đổi kháng thể (liên kết kháng nguyên-kháng thể).Biến đổi hóa học là một cách sớm của enzyme khởi động nóng.Khi đạt đến một nhiệt độ nhất định, enzyme sẽ giải phóng hoạt động của nó.Enzyme khởi động nóng được biến đổi kháng thể sử dụng các phương pháp sinh học để ngăn chặn hoạt động của enzyme.Khi đạt đến một nhiệt độ nhất định, kháng thể sẽ bị biến tính và bất hoạt dưới dạng protein, và hoạt động của enzyme sẽ phát huy tác dụng.

Tuy nhiên, việc sử dụng này là gì?Trong trường hợp này, hoạt động giải phóng của enzyme biến đổi kháng thể nhanh hơn so với enzyme biến đổi hóa học, vì vậy về độ nhạy, enzyme biến đổi kháng thể có một chút lợi thế, do đó về cơ bản không có enzyme biến đổi hóa học nào trong bộ dụng cụ trên thị trường.Nếu có, thì công nghệ của nhà sản xuất này vẫn đang bị mắc kẹt trong thời đại của thiên niên kỷ.
Nồng độ ion magie:Nồng độ ion magie rất quan trọng trong phản ứng PCR.Nồng độ ion magie thích hợp có thể thúc đẩy giải phóng hoạt tính của enzym Taq.Nếu nồng độ quá thấp sẽ làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme;nếu nồng độ quá cao, sự khuếch đại không đặc hiệu do enzyme xúc tác sẽ được tăng cường.Nồng độ của các ion magiê cũng sẽ ảnh hưởng đến quá trình ủ mồi, nhiệt độ nóng chảy của khuôn mẫu và sản phẩm PCR, do đó ảnh hưởng đến sản lượng của các đoạn khuếch đại.Nồng độ của các ion magie thường được kiểm soát ở mức 25mM.Tất nhiên, để có một bộ dụng cụ tốt, nồng độ ion magie phải được kiểm soát tốt.Một số thương nhân thêm tác nhân chelate ion magie vào thuốc thử, chất này có thể đạt được hiệu quả điều chỉnh tự động nồng độ ion magie.
Nồng độ thuốc nhuộm huỳnh quang:Thuốc nhuộm huỳnh quang, là loại SYBR Green mà chúng ta thường sử dụng, chủ yếu tạo ra huỳnh quang bằng cách liên kết với rãnh nhỏ của DNA sợi kép, vì liên kết của thuốc nhuộm với DNA sợi kép là không đặc hiệu, nghĩa là miễn là DNA sợi kép được kết hợp với nó, thì có thể phát huỳnh quang, do đó, các đoạn mồi và mẫu DNA trong hệ thống sẽ kết hợp với nó để tạo thành tín hiệu nền.
PS: Do đặc tính nhạy cảm với ánh sáng, các sản phẩm trên thị trường thường được đóng gói trong các ống ly tâm màu nâu đục (như hình bên dưới).Tuy nhiên, điều này sẽ gặp phải một vấn đề.Rất khó để xem liệu chất lỏng có bị hút khi lấy mẫu hay không.Về mặt này, Qingke thực sự thân thiện với người dùng nhất (như trong hình bên dưới) và ống trong suốt được đóng gói trong một túi thiếc mờ đục.Sau đó cho vào túi thiếc, có tính đến sự tiện lợi trong việc tránh ánh sáng và lấy mẫu.Bạn phải chọn đúng số sản phẩm.TSE204 là một sự tồn tại siêu tiết kiệm chi phí, khiến tôi muốn trồng cỏ.

Nồng độ của thuốc nhuộm huỳnh quang cũng rất quan trọng.Nếu nồng độ quá thấp, đường cong khuếch đại sẽ không đi lên trong giai đoạn sau và không hoàn hảo;nếu nồng độ quá cao sẽ gây nhiễu âm thanh.Vì PCR định lượng huỳnh quang chủ yếu phụ thuộc vào giá trị CT, nếu nồng độ của thuốc nhuộm huỳnh quang không được điều chỉnh đúng cách, điểm thấp sẽ tốt hơn điểm cao.Tất nhiên, nồng độ thuốc nhuộm thích hợp là tốt nhất.

ROX: Thuốc nhuộm ROX được sử dụng để sửa lỗi tín hiệu huỳnh quang từ giếng đến giếng.Một số nhà sản xuất thiết bị yêu cầu hiệu chuẩn, trong khi những nhà sản xuất khác thì không.Ví dụ: việc sử dụng thiết bị khuếch đại PCR thời gian thực của Thermo Fisher Khoa học thường yêu cầu hiệu chuẩn, bao gồm 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, v.v. Hướng dẫn chung của bộ công cụ sẽ mô tả điều này.
Foregene's qPCR Mix cũng chứa thuốc nhuộm ROX, thuận tiện để sử dụng trong các mô hình khác nhau.

Real Time PCR Kit-Taqman

Xử lý liên kết hydro yếu: Việc xử lý các liên kết hydro yếu là một vấn đề tương đối kỹ thuật.Không có gì đã đọc hướng dẫn sử dụng của nhiều bộ dụng cụ, nhưng không ai trong số họ đề cập đến chủ đề này.Trên thực tế, nó rất quan trọng.Sự kết hợp của các bazơ chủ yếu phụ thuộc vào độ bền của liên kết hydro.Liên kết hydro mạnh là sự khuếch đại bình thường và liên kết hydro yếu dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu.Nếu không thể loại bỏ tốt các liên kết hydro yếu, thì không thể tránh được sự khuếch đại không đặc hiệu.Trong phạm vi của tác giả, chỉ có một số công ty nhận thấy vấn đề này.Khi bạn mua bộ sản phẩm, bạn có thể tham khảo xem bạn đã cân nhắc giải pháp nào về vấn đề này cho bộ sản phẩm bạn muốn chọn hay chưa.

khối lượng phản ứng: Hệ thống 20-50ul được sử dụng phổ biến hơn và thể tích nhỏ hơn có khả năng gây ra lỗi.Nói chung, hướng dẫn của bộ dụng cụ sẽ khuyến nghị sử dụng thể tích phản ứng PCR.Đừng thông minh và sử dụng khối lượng nhỏ hơn để tiết kiệm chi phí.mục đích của.Khối lượng được người bán đề xuất đã thực sự được thử nghiệm và có thể họ không thể giải quyết vấn đề lỗi do khối lượng nhỏ gây ra.
2. Nhà sản xuất và số hiệu của tấm ống
Mọi người đều biết nguyên tắc PCR định lượng huỳnh quang.Việc thu thập huỳnh quang chủ yếu được thực hiện thông qua nắp ống PCR.Khi chọn vật tư tiêu hao cho PCR, hãy chú ý đến hai điểm: độ truyền sáng tốt và phù hợp với thiết bị.Nói chung, bảng và ống của các thương hiệu phổ thông đều ổn, nhưng bạn phải lựa chọn cẩn thận về mặt thích ứng, nếu không bạn sẽ không thể sử dụng nhạc cụ.

4. Kiến thức cấp cao nhất

MIQE (8)—xác thực qPCR
Đây là ưu tiên hàng đầu của qPCR!Biết bao anh hùng đã ngã xuống cát bụi nơi đây.Tất nhiên, cũng có thể do bạn may mắn và gen bạn nghiên cứu đơn giản nên bạn đã trôi theo chiều gió qua hang băng.Thông tin xác minh của qPCR nhằm mục đích kiểm tra độ tin cậy của dữ liệu.Chúng tôi liệt kê các thông tin xác minh cần thiết như sau:

1. Kiểm tra độ đặc hiệu
Tính đặc hiệu của khuếch đại gen mục tiêu được kiểm tra bằng cách kiểm tra xem hình ảnh điện di có phải là một dải đơn hay không;xác minh trình tự;đường cong nóng chảy để xem bản đồ đỉnh có đơn lẻ không;xác minh tiêu hóa enzyme và các phương pháp khác.
Ở đây, chúng tôi tập trung vào tanh ta phân tích sự khuếch đại không đặc hiệu bằng phương pháp làm nóng chảy các đường cong.Nói chung, khi chúng tôi thiết kế mồi, kích thước của đoạn sản phẩm được yêu cầu nằm trong khoảng 80-200bp, làm cho nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR nằm trong khoảng 80-85 ° C.Do đó, nếu có các đỉnh linh tinh, phải có các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu khác;nếu đỉnh xuất hiện dưới 80°C, nó thường được coi là dime mồi;nếu đỉnh xuất hiện trên 85°C, nó thường được coi là nhiễm bẩn DNA hoặc hơn thế nữa là sự khuếch đại không đặc hiệu của các đoạn lớn.
Lưu ý: Đôi khi chỉ có một đỉnh duy nhất ở 80°C.Tại thời điểm này, khái niệm này phải được tôn trọng.Có khả năng là các kết quả khuếch đại đều là các bộ điều chỉnh độ sáng mồi.

Đường cong nóng chảy bình thường (đỉnh đơn không có khuếch đại không đặc hiệu)

Đường cong nóng chảy có vấn đề (khuếch đại không đặc hiệu của các đỉnh giả)
【Phân tích trường hợp】

Có một đỉnh chính, nhưng độ mờ của mồi rất nghiêm trọng
Đường cong nóng chảy đỉnh đơn trong hình dưới đây có thể dễ dàng đánh lừa thị giác của bạn, nghĩ rằng đó là một thí nghiệm hoàn hảo, nhưng kết quả lại hoàn toàn sai.Tại thời điểm này, chúng ta phải xem xét nhiệt độ nóng chảy.Nhiệt độ cao nhất là dưới 80°C, hoàn toàn là primer-dimer.

Không có đoạn mục tiêu, tất cả các bộ điều chỉnh độ sáng mồi
Ở đây, anh tôi không thể dừng lại.Bức ảnh dưới đây là một bức ảnh được chụp bằng điện thoại di động do một tên lừa đảo gửi cho tôi.Thuốc thử anh ấy sử dụng đều là những nhãn hiệu thông dụng trong ngành.Anh ấy đã thay đổi từ nhãn hiệu tiền tố T này sang nhãn hiệu tiền tố T khác.Tôi nghĩ bạn đã đoán ra rồi.Tên khốn đó đã khóc với tôi: “Thuốc thử được sử dụng trong bức tranh đầu tiên quá tốt, và đỉnh là duy nhất.Sau đó, sau khi sử dụng thuốc thử mà bạn đề xuất, nó sẽ giống như hình thứ hai, với các đỉnh hỗn hợp.Bạn đã làm cho tôi đau khổ.“
Tách hai đồ thị.Thoạt nhìn, một cái có đỉnh đơn và cái kia có đỉnh kép.Vô nghĩa, một đỉnh duy nhất tất nhiên là tốt.Điều đó có đúng không?
Còn tệ hơn Dou E thì mình đặt 2 tấm hình dưới đây các bạn sẽ hiểu ngay.Trên thực tế, chúng ta dễ dàng bị tê liệt bởi loại hình ảnh này.Sau khi phân tích cẩn thận, chúng tôi nhận thấy rằng: đỉnh của hình đầu tiên là ở 75°C, là dime mồi hoàn toàn;đỉnh của hình thứ hai xuất hiện ở 75°C và 82°C, ít nhất có Sản phẩm xuất hiện.

Hình ảnh phản hồi của học viên
Vì vậy, vấn đề cơ bản không phải là vấn đề thuốc thử, mà là vấn đề thiết kế mồi.Đồng thời, nó cũng chứng minh rằng một số thương hiệu lớn không phải là chất lượng sắt, và nó cũng chứng minh những gì anh trai tôi đã nói trước đây: Không phải thương hiệu thuốc thử hỗ trợ cho bài viết của bạn.Chính bài báo của bạn đã nâng đỡ thương hiệu thuốc thử.Thử tưởng tượng xem, nếu tên khốn đó không thay đổi thuốc thử, dữ liệu sai sẽ được gửi đến tạp chí, và điều gì sẽ xảy ra sẽ là một bi kịch.
2. Giá trị Ct của đối chứng trắng
Đừng giải thích, nếu đối chứng trống có giá trị Ct, thì đó có phải là ô nhiễm không?Tuy nhiên, bạn vẫn cần hiểu điều khiển trống nào có giá trị Ct.Nếu đó là NTC, điều đó có nghĩa là có DNA lạ như nhiễm bẩn thuốc thử.Nếu là NRT, điều đó có nghĩa là RNA được chiết xuất có nhiễm DNA.
3. Đường chuẩn
Bao gồm độ dốc và công thức tính toán, hiệu quả PCR có thể được tính toán thông qua công thức.Một thử nghiệm hoàn hảo yêu cầu độ dốc của đường chuẩn phải đạt tới 3,32 và R² đạt tới 0,9999.
4. Dải động tuyến tính
Phạm vi động của phản ứng là tuyến tính.Theo mẫu được sử dụng để tạo đường chuẩn, dải động phải bao gồm ít nhất 5 gradient nồng độ và chú ý đến sự thay đổi giá trị Ct ở gradient nồng độ cao và gradient nồng độ thấp.
5. Độ chính xác phát hiện
Những thay đổi trong kết quả qPCR, nghĩa là độ lặp lại kém, nghĩa là độ chính xác kém, do nhiều yếu tố gây ra, bao gồm nhiệt độ, nồng độ và hoạt động.Độ chính xác của qPCR thường trở nên khó kiểm soát hơn khi số lượng bản sao giảm.Lý tưởng nhất là biến thể trong thử nghiệm, biến thể kỹ thuật này phải khác biệt với biến thể sinh học và các bản sao sinh học có thể giải quyết trực tiếp sự khác biệt thống kê về kết quả qPCR giữa các nhóm hoặc phương pháp điều trị.Đặc biệt đối với các xét nghiệm chẩn đoán, độ chính xác tốt nhất giữa các xét nghiệm (độ lặp lại) giữa các địa điểm và người vận hành phải được báo cáo.
6. Hiệu quả phát hiện và LOD (trong multiplex qPCR)
LOD là nồng độ thấp nhất 95% mẫu dương tính được phát hiện.Nói cách khác, nồng độ LOD chứa trong một tập hợp các bản sao gen mục tiêu không được vượt quá 5% các phản ứng thất bại.Khi thực hiện phân tích qPCR ghép kênh, đặc biệt là để phát hiện đồng thời các đột biến điểm hoặc đa hình, qPCR ghép kênh cần cung cấp bằng chứng cho thấy độ chính xác của nhiều đoạn mục tiêu không bị ảnh hưởng trong cùng một ống, Hiệu quả phát hiện nhiều ống và phát hiện một ống phải giống nhau.Đặc biệt khi gen mục tiêu nồng độ cao và gen mục tiêu nồng độ thấp được khuếch đại đồng thời, vấn đề này phải được chú ý.
Các vấn đề và giải phápNói chung, các vấn đề thường gặp phải khi gỡ lỗi qPCR tập trung vào các khía cạnh sau:
·khuếch đại không đặc hiệu
·Khó lựa chọn nồng độ primer và rắc rối với primer-dimers
·Nhiệt độ ủ không chính xác
·Cấu trúc thứ cấp ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại
khuếch đại không đặc hiệu
khuếch đại không đặc hiệuxảy ra , người ta thường xem xét liệu thiết kế sơn lót có phù hợp hay không, nhưng nếu bạn không vội thay đổi sơn lót, trước tiên bạn có thể thử các phương pháp sau (nguyên tắc cũng được đính kèm):
·Tăng nhiệt độ ủ – cố gắng làm cho các liên kết hydro yếu không duy trì được;
· Rút ngắn thời gian ủ và kéo dài – giảm khả năng liên kết hydro yếu;
·Giảm nồng độ mồi – giảm cơ hội gắn mồi dư thừa và các vùng không phải mục tiêu;
Hiệu suất khuếch đại thấp
Tình huống ngược lại với khuếch đại không đặc hiệu – hiệu suất khuếch đại thấp và các biện pháp xử lý hiệu suất khuếch đại thấp thì ngược lại:
·Kéo dài thời gian ủ và kéo dài thời gian;
·Chuyển sang PCR ba bước và giảm nhiệt độ ủ;
·Tăng nồng độ mồi;
Ps: Nhiều sinh viên tốt nghiệp những năm 90 không muốn nghiên cứu cách gỡ lỗi thí nghiệm và hy vọng rằng bộ dụng cụ này có thể giải quyết hoàn toàn vấn đề (nếu bạn muốn đến một công ty thuốc thử để nghiên cứu và phát triển sau khi tốt nghiệp), trên thực tế, các nhà sản xuất thuốc thử cũng nghĩ theo cách này, tôi hy vọng nó là một kẻ ngốc. Nó có thể được sử dụng khi bạn nhận được nó, vì vậy các nhà sản xuất thuốc thử đã dành rất nhiều nỗ lực để giải quyết vấn đề khuếch đại không đặc hiệu, bao gồm cả việc đưa vào các hệ số hấp thụ liên kết H yếu.Để dễ dàng giải quyết vấn đề, những kẻ ngu ngốc vẫn phải đọc phần giới thiệu của công ty thuốc thử để xem liệu có một yếu tố hấp thụ các liên kết hydro yếu hay không.
Khó lựa chọn nồng độ primer và rắc rối với primer-dimer
Phương pháp 1: Nói chung, hướng dẫn bộ công cụ dành cho qPCR có các hệ thống khuyến nghị và nồng độ mồi khuyến nghị.
Phương pháp 2: Gỡ lỗi bằng cách đặt gradient nồng độ mồi.Hình bên dưới ăn trộm của 1 hãng để minh họa.Hình dưới đây cho thấy các kết quả định lượng huỳnh quang được thực hiện với ba gradient nồng độ mồi (100nM, 250nM, 500nM) và bốn gradient nồng độ mẫu (0,1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Giá trị Ct của kết quả thí nghiệm được vẽ như sau:

Lựa chọn nồng độ sơn lót Nối mỗi nồng độ sơn lót thành một dòng như sau:

Sự lựa chọn nồng độ mồi là rõ ràng, mối quan hệ tuyến tính của nồng độ mồi 100nM và 250nM là tốt hơn, và mối quan hệ tuyến tính của nồng độ mồi 500nM tương đối kém.Trong 100nM và 250nM, giá trị Ct của 250nM tương đối nhỏ nên nồng độ mồi tối ưu là 250nM.Nhìn chung, có thể nhìn thấy các chất làm mờ mồi nghiêm trọng trong đường cong nóng chảy.Điều gì sẽ xảy ra nếu các đoạn mồi được thiết kế không thể tránh được các đoạn mồi làm mờ?
Phương pháp 3: Giảm lượng mồi và tăng nhiệt độ ủ (không cần giải thích).
Giá trị thực nghiệm của nhiệt độ ủ là 60°C.Nếu bạn không chắc chắn, làm thế nào để chọn nhiệt độ ủ phù hợp hơn?Câu trả lời cũng giống như việc lựa chọn nồng độ sơn lót –kiểm tra độ dốc.Chụp ảnh từ công ty Bio-rad để minh họa vấn đề.Để khuếch đại một đoạn mục tiêu nhất định, hãy đặt tám độ dốc nhiệt độ, mỗi độ dốc có ba lần lặp lại và đường cong khuếch đại thu được như sau:

lựa chọn nhiệt độ ủ:
·70°C, 69°C—Về cơ bản, các đoạn mồi không thể kết hợp với nhau nên không có sự khuếch đại.
·67,3°C – Lúc đầu có một lượng khuếch đại nhỏ và giá trị Ct tương đối lớn.
·64,5°C——Giá trị Ct giảm.
·Ở 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C và 55,0°C, các giá trị Ct về cơ bản có xu hướng ổn định, nhưng các giá trị huỳnh quang cuối cùng thì khác.
Làm thế nào để lựa chọn?Nguyên tắc: Nguyên tắc đầu tiên là giá trị Ct cao hơn.Đối với cùng một giá trị Ct, chọn nhiệt độ ủ cao hơn để tránh hiện tượng dime hóa và khuếch đại không đặc hiệu.Mặc dù có giá trị huỳnh quang cao hơn ở 55°C, nhưng có thể có độ mờ hoặc độ khuếch đại không đặc hiệu trong đó.
Nhưng nếu bạn thông minh như bạn, bạn chắc chắn sẽ nghĩ: Nói theo logic, nếu phản ứng PCR rất đặc hiệu, chỉ cần nồng độ mồi vượt quá yêu cầu tối thiểu, điểm cao và điểm thấp sẽ không có tác dụng gì, giống như thuốc nhuộm huỳnh quang và dNTP.Thật vậy, miễn là nhiệt độ ủ được tối ưu hóa đúng cách, ảnh hưởng của nồng độ mồi đến giá trị Ct sẽ được giảm thiểu một cách tự nhiên.

Nhiệt độ ủ được tối ưu hóa đúng cách và ảnh hưởng của nồng độ mồi lên CT sẽ được giảm thiểu
Cấu trúc thứ cấp ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại
Hãy lấy hình ảnh từ Bio-rad để minh họa vấn đề.Nó cũng thiết kế một gradient nhiệt độ để khuếch đại một gen có cấu trúc thứ cấp.

Cấu trúc thứ cấp xuất hiện
Có thể thấy rằng khi gradient nhiệt độ giảm, các sản phẩm bắt đầu xuất hiện và giá trị Ct tăng dần, đạt giá trị tối thiểu ở 60,7°C, sau đó khi gradient nhiệt độ giảm, giá trị Ct sẽ lớn hơn.Ngược lại, khi nhiệt độ tăng, cấu trúc thứ cấp mở ra và hiệu suất khuếch đại tăng.Sau khi đạt đến một nhiệt độ nhất định, việc tăng nhiệt độ không thể cải thiện hiệu suất khuếch đại.Vì lúc này các primer không thể kết hợp ổn định với nhau được.Vì thế,tìm nhiệt độ có giá trị Ct thấp nhất, đó là nhiệt độ tốt nhất để khuếch đại mẫu cấu trúc thứ cấp!Tất nhiên, những kẻ ngu ngốc thông minh phải biết rằng nếu không cần thiết, tốt nhất là thay đổi mồi và tránh vùng cấu trúc thứ cấp.
5. Mức độ ứng dụng
MIQE—Phân tích dữ liệu

Việc phân tích dữ liệu chủ yếu được đưa ra bởi công cụ PCR định lượng huỳnh quang.Trong bài viết trước, rất nhiều công việc phân tích dữ liệu đã được thực hiện, chẳng hạn như kiểm soát trống, đã được giải thích trong thiết kế thử nghiệm.Các gen tham chiếu nội bộ, số lặp lại, v.v. đã được làm rõ., ở đây chúng tôi chủ yếu giải thích ứng dụng của qPCR.
qPCR được sử dụng rộng rãi và xác minh bằng thực nghiệm và chẩn đoán axit nucleic là những tình huống được sử dụng phổ biến nhất.
định lượng tuyệt đối
Log (nồng độ ban đầu) có mối quan hệ tuyến tính với số chu kỳ.Một đường cong tiêu chuẩn có thể được vẽ từ một tiêu chuẩn với số lượng bản sao ban đầu đã biết, nghĩa là có thể thu được mối quan hệ tuyến tính của phản ứng khuếch đại.Theo giá trị Ct của mẫu, nồng độ trong mẫu có thể được tính toán.Số lượng mẫu để bao gồm.

Phương pháp tính định lượng tuyệt đối
Việc định lượng tuyệt đối phải dựa vào đường chuẩn.Để thực hiện một đường cong tiêu chuẩn, một tiêu chuẩn được yêu cầu.Thông thường, tiêu chuẩn là một plasmid thu được bằng cách nhân bản gen mục tiêu.Tại sao nó là một plasmit?Vì DNA plasmid vòng là ổn định nhất.Pha loãng sản phẩm tiêu chuẩn theo 5 đến 6 độ dốc theo tỷ lệ nhân đôi (pha loãng 10 lần) và chú ý đến độ đồng nhất khi pha loãng.Để giá trị Ct rơi vào khoảng 15-30.

chuẩn bị
Đồng thời, mẫu cần xét nghiệm cũng cần được pha loãng cho phù hợp (nhớ hệ số pha loãng), và giá trị Ct cũng nên rơi vào khoảng 15-30.Sản phẩm tiêu chuẩn + mẫu cần kiểm tra được đưa vào máy cùng nhau.Sau khi chạy, dựng đường chuẩn với chất chuẩn, mẫu cần kiểm tra được đưa vào đường chuẩn để tính nồng độ.
Định lượng virus viêm gan B HBV là một định lượng tuyệt đối điển hình, có thể tính được số copy của virus trong 1ml máu.
Tính toán số lượng bản sao
Nồng độ mẫu cần kiểm tra (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × hệ số pha loãng
Trọng lượng phân tử mẫu = số base × 324
Số bản sao của mẫu cần kiểm tra (bản sao/ul) = nồng độ của mẫu cần kiểm tra / trọng lượng phân tử của mẫu × 6 × 1014

Phương pháp tính số lượng bản sao

Trên đây là cách tính để xác định đại lượng.Đây là dạng toán sau khi tốt nghiệp trung học cơ sở có thể giải được, các dạng toán nói chung đều được giải bằng máy tính.Nếu bạn không hiểu, bạn có thể đến để trao đổi.
định lượng tương đối
Định lượng tương đối được sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu khoa học.Có bao nhiêu vi-rút trong 1ml máu và đó là vi-rút DNA, đây là một sự kiện tương đối xác định: lượng máu có thể được xác định và vi-rút DNA tương đối ổn định.Tuy nhiên, chúng ta khó so sánh số lượng bản sao phiên mã của một gen nhất định trong một chiếc lá, bởi vì rất khó xác định kích thước, trọng lượng và độ mềm của lá, lượng RNA chiết xuất khó xác định và hiệu quả của phiên mã ngược cũng khó xác định, tức là bất kỳ bước nào cũng có thể khiến dữ liệu thí nghiệm có lỗi và không thể sử dụng được.
Do đó, định lượng tương đối phải giới thiệu một yếu tố:gen tham chiếu bên trong.
Nói cách khác, định lượng tương đối thực chất là so sánh giữa gen mục tiêu và gen tham chiếu bên trong.So sánh trong cùng một mô và cùng một tế bào, ảnh hưởng của kích thước mẫu, lượng chiết xuất RNA, hiệu quả phiên mã ngược và hiệu quả PCR là tương đối nhỏ.Do kích thước mẫu nhỏ, cả gen tham chiếu bên trong và gen mục tiêu đều giảm tương đối.Đây là lý do tại sao chúng tôi đã nhấn mạnh tính đồng nhất và ổn định trước đây.
Các gen tham chiếu bên trong nói chung làgen giữ nhà(house-keeper genes) dùng để chỉ một loại gen được biểu hiện ổn định trong mọi tế bào và các sản phẩm của chúng cần thiết để duy trì các hoạt động sống cơ bản của tế bào.
Đừng nhầm lẫn khái niệm này.Gen giữ nhà là thuật ngữ chức năng sinh học, trong khi gen tham chiếu bên trong là thuật ngữ kỹ thuật thử nghiệm.Các gen giữ nhà cần phải vượt qua xác nhận trước khi chúng có thể được chọn làm gen tham chiếu nội bộ.
Ví dụ: chúng tôi đã chọn một số gen giữ nhà trong hình bên dưới để kiểm tra mức độ biểu hiện của chúng trong các tế bào mô khác nhau và nhận thấy rằng mức độ biểu hiện của β-2-microglobulin khá khác so với mức độ biểu hiện của ba gen còn lại, vì vậy chúng không thể được sử dụng làm gen tham chiếu nội bộ.

Sau khi hiểu chức năng hiệu chỉnh của gen tham chiếu bên trong, hai thuật toán được rút ra do sự ra đời của gen tham chiếu bên trong.
·phương pháp đường chuẩn kép
·2 – Phương pháp △△Ct (phương pháp so sánh giá trị CT)
Nếu bạn quan tâm đến việc nghiên cứu các loài và chức năng của gen, xin vui lòng từ bỏ nghiên cứu về các thuật toán và sử dụng trực tiếp các công thức, hoặc sử dụng máy móc trực tiếp;nếu bạn là một người thẳng thắn về toán học và kỹ thuật, xin vui lòng.
phương pháp đường chuẩn kép
Định lượng gen mục tiêu và gen giữ nhà của mẫu đối chứng và mẫu cần kiểm tra thông qua đường chuẩn, sau đó tính giá trị tương đối theo công thức tính, là mức biểu hiện tương đối.
Ưu điểm: phân tích đơn giản, tối ưu hóa thử nghiệm tương đối đơn giản
Nhược điểm: Đối với mỗi gen, mỗi đợt thí nghiệm phải lập đường chuẩn
Ứng dụng: Một trong hai phương pháp định lượng tương đối được sử dụng và công nhận phổ biến nhất trong nghiên cứu điều hòa biểu hiện gen
Công thức như sau:

Ví dụ như sau:

Tính lượng tương đối dựa trên kết quả định lượng
2 – Phương pháp △△Ct (phương pháp so sánh giá trị CT)

Ưu điểm: Không cần tạo đường cong chuẩn
Nhược điểm: Người ta cho rằng hiệu suất khuếch đại gần 100%;độ lệch chuẩn < 5% và đường cong chuẩn cũng như hiệu suất giữa mỗi lần khuếch đại được giả định là nhất quán;việc tối ưu hóa các điều kiện thí nghiệm phức tạp hơn.
Ứng dụng: Một trong hai phương pháp định lượng tương đối được sử dụng và công nhận phổ biến nhất trong nghiên cứu điều hòa biểu hiện gen

Tất nhiên, hiệu suất khuếch đại thường không thể hoàn hảo 1. Phương pháp hiệu chỉnh: Nếu chúng ta biết rằng gen mục tiêu và gen tham chiếu có hiệu suất khuếch đại như nhau, nhưng hiệu suất khuếch đại không bằng 1, thì 2－△△Ct có thể được hiệu chỉnh thành: (1+E )－△△Ct, ví dụ, nếu hiệu suất khuếch đại là 0,95, thì công thức tính toán có thể được hiệu chỉnh thành 1,95－ △△Ct
Đến đây nội dung về PCR định lượng huỳnh quang đã kết thúc.