Hướng dẫn phân tích vấn đề

The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。

Không chiết xuất được RNA hoặc sản lượng axit nucleic thấp

Thông thường có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả thu hồi như: hàm lượng RNA mẫu, phương pháp vận hành, thể tích rửa giải, v.v.。

Phân tích các nguyên nhân phổ biến：

1. Bể nước đá hoặc ly tâm ở nhiệt độ thấp (4 ° C) trong quá trình vận hành.

Đề xuất: Hoạt động ở nhiệt độ phòng (15-25 ° C), không bao giờ ngâm nước đá và máy ly tâm ở nhiệt độ thấp.

2. Bảo quản mẫu không đúng cách hoặc lưu mẫu quá lâu.

Đề xuất: Bảo quản mẫu ở -80 ° C hoặc đông lạnh trong nitơ lỏng và tránh sử dụng đông lạnh-rã đông nhiều lần;cố gắng sử dụng các mẫu mới được thu thập để chiết xuất RNA.

3. Ly giải mẫu không đủ

Khuyến nghị: Vui lòng đảm bảo rằng mẫu và dung dịch làm việc (Acrylamide tuyến tính) đã được trộn kỹ và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng (15-25 ° C)

4. Dung dịch rửa giải được thêm vào không chính xác

Khuyến nghị: Đảm bảo rằng RNase-Free ddH2O được thêm vào giữa màng của cột tinh chế

5.Thể tích ethanol khan không phù hợp trong Buffer viRW2

Đề xuất: Vui lòng làm theo hướng dẫn, thêm đúng lượng ethanol khan vào Buffer viRW2 và trộn đều trước khi sử dụng bộ sản phẩm。

6. Sử dụng mẫu không đúng cách.

Gợi ý: 200µl mẫu trên 500μl Buffer viRL.Thể tích mẫu quá nhiều sẽ làm giảm tốc độ chiết xuất RNA.

7. Thể tích rửa giải không đúng hoặc rửa giải không đầy đủ.

Gợi ý: Thể tích rửa giải của cột tinh chế là 30-50μl;nếu hiệu quả rửa giải không đạt yêu cầu, nên thêm ddH không chứa RNase đã được làm nóng trước₂O và kéo dài thời gian đặt ở nhiệt độ phòng, chẳng hạn như 5-10 phút

8.Cột lọc có cặn ethanol sau khi rửa trong Buffer viRW2.

Gợi ý: Nếu etanol vẫn còn sau khi rửa trong Buffer viRW2 và ly tâm ống rỗng trong 2 phút, cột tinh chế có thể được để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút sau khi ly tâm ống rỗng để loại bỏ hoàn toàn etanol còn lại.

Sự xuống cấp của các phân tử RNA tinh khiết

Chất lượng của RNA tinh khiết có liên quan đến các yếu tố như bảo quản mẫu, nhiễm RNase và vận hành.

Phân tích các nguyên nhân phổ biến：

1. Các mẫu được thu thập không được lưu trữ kịp thời.

Đề xuất: Nếu mẫu không được sử dụng kịp thời sau khi lấy, vui lòng bảo quản mẫu ở -80 ℃ hoặc nitơ lỏng ngay lập tức.Để chiết xuất các phân tử RNA, hãy cố gắng sử dụng các mẫu mới được thu thập bất cứ khi nào có thể.

2. Các mẫu đã thu thập bị đóng băng và rã đông nhiều lần.

Đề xuất: Tránh đông lạnh và rã đông nhiều lần (không quá một lần) trong quá trình lấy và bảo quản mẫu, nếu không sản lượng axit nucleic sẽ giảm.

3.RNase được đưa vào phòng mổ hoặc không đeo găng tay, khẩu trang, v.v. dùng một lần.

Gợi ý: Thí nghiệm tách chiết phân tử ARN tốt nhất nên thực hiện trong phòng thao tác ARN riêng biệt, bàn thí nghiệm được vệ sinh sạch sẽ trước khi thí nghiệm.Đeo găng tay và khẩu trang dùng một lần trong suốt quá trình thí nghiệm để tránh sự phân hủy RNA do đưa RNase vào.

4. Thuốc thử bị nhiễm RNase trong quá trình sử dụng.

Đề xuất: Thay thế bằng Bộ tách RNA Vi-rút mới cho các thí nghiệm liên quan.

5. Sự nhiễm bẩn RNase của các ống ly tâm, đầu pipet, v.v. Đề xuất: Đảm bảo rằng các ống ly tâm, đầu pipet và pipet đều không có RNase.

Các phân tử RNA tinh khiết đã ảnh hưởng đến các thí nghiệm xuôi dòng

Các phân tử RNA được tinh chế bằng cột tinh chế sẽ ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp theo nếu có quá nhiều ion muối hoặc protein, chẳng hạn như: phiên mã ngược, Northern Blot, v.v.。

1. Có các ion muối còn lại trong các phân tử RNA được rửa giải.

Khuyến nghị: Đảm bảo rằng lượng etanol khan đã được thêm chính xác vào Bộ đệm viRW2 và rửa cột tinh chế hai lần theo tốc độ ly tâm chính xác trong hướng dẫn vận hành; Nếu vẫn còn các ion muối, bạn có thể thêm Bộ đệm viRW2 vào cột tinh chế và để nó ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.Sau đó thực hiện ly tâm để loại bỏ ô nhiễm ion muối ở mức độ lớn nhất

2.Có ethanol còn lại trong các phân tử RNA rửa giải

Gợi ý: sau khi xác nhận rằng các cột tinh chế đã được rửa sạch bằng Buffer viRW2, hãy thực hiện ly tâm ống rỗng theo tốc độ ly tâm trên hướng dẫn vận hành.Nếu vẫn còn ethanol, có thể để yên trong 5 phút ở nhiệt độ phòng sau khi ly tâm trong ống rỗng để loại bỏ lượng ethanol còn lại ở mức tối đa.

Tài liệu chỉ dẫn:

Hướng dẫn sử dụng Kit phân lập RNA virus