Ai cũng biết rằng theo giáo điều trung tâm, RNA là chất trung gian phiên mã giữa biểu hiện DNA và protein.So với việc phát hiện DNA, việc phát hiện RNA có thể phản ánh khách quan hơn biểu hiện gen ở sinh vật.Các thí nghiệm liên quan đến RNA bao gồm: qRT-PCR, RNA-Seq và phát hiện gen dung hợp, v.v. Dựa trên đặc điểm của chính RNA (vòng đường của RNA có nhiều nhóm hydroxyl tự do hơn vòng đường của DNA), cùng với số lượng lớn RNase trong môi trường, RNA không ổn định và dễ bị phân hủy hơn DNA.Rác vào, rác ra, nếu chất lượng RNA không tốt, thì kết quả thí nghiệm phải không đạt yêu cầu, biểu hiện cụ thể là dữ liệu không chính xác hoặc độ lặp lại kém.Do đó, cần chú ý nhiều hơn đến quá trình xử lý RNA và liên kết kiểm soát chất lượng cũng quan trọng hơn để đảm bảo độ chính xác và độ chính xác của dữ liệu thử nghiệm tiếp theo.

Để kiểm soát chất lượng của RNA, thường có các phương pháp thường được sử dụng sau đây:

• quang phổ
• điện di trên gel agarose
• Máy phân tích sinh học Agilent
• PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực
• Phương pháp nhuộm huỳnh quang Qubit

01 Máy đo quang phổ

ARN có liên kết đôi liên hợp và có cực đại hấp thụ ở bước sóng 260nm.Theo định luật Lambert-Beer, chúng ta có thể tính được nồng độ RNA từ đỉnh hấp thụ ở 260nm.Ngoài ra, chúng ta cũng có thể tính độ tinh khiết của RNA theo tỷ lệ của các đỉnh hấp thụ 260nm, 280nm và 230nm.280nm và 230nm lần lượt là các cực đại hấp thụ của protein và các phân tử nhỏ.Tỷ lệ A260/A280 và A260/A230 của độ tinh khiết RNA đủ điều kiện phải lớn hơn 2. Nếu nhỏ hơn 2, điều đó có nghĩa là mẫu RNA có chứa protein hoặc phân tử nhỏ và cần được tinh chế lại.Các nguồn ô nhiễm sẽ ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp theo, chẳng hạn như ức chế hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR, dẫn đến kết quả định lượng không chính xác.Độ tinh khiết của RNA có ảnh hưởng lớn đến các kết quả tiếp theo, do đó, phép đo quang phổ nói chung là một liên kết kiểm soát chất lượng không thể thiếu trong bước đầu tiên trong các thí nghiệm axit nucleic.

Hình 1. Phổ hấp thụ RNA/DNA điển hình

02 Điện di trên gel agarose

Ngoài độ tinh khiết, tính toàn vẹn của RNA cũng là một trong những chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng của RNA.Sự phân hủy của RNA sẽ dẫn đến một số lượng lớn các đoạn ngắn trong mẫu, do đó số lượng các đoạn RNA có thể được phát hiện và bao phủ một cách hiệu quả bởi trình tự tham chiếu sẽ giảm đi.Tính toàn vẹn của RNA có thể được kiểm tra bằng điện di RNA tổng số trên gel agarose 1%.Phương pháp này có thể tự định cấu hình gel hoặc sử dụng Hệ thống E-Gel™ đúc sẵn để kiểm tra tính toàn vẹn.Hơn 80% tổng số RNA là RNA ribosome, phần lớn trong số đó bao gồm rRNA 28S và 18S (trong hệ thống động vật có vú).RNA chất lượng tốt sẽ hiển thị hai vạch sáng rõ ràng, lần lượt là các vạch sáng 28S và 18S, ở 5 Kb và 2 Kb, và tỷ lệ sẽ có xu hướng gần với 2:1.Nếu nó ở trạng thái khuếch tán, điều đó có nghĩa là mẫu RNA có thể đã bị phân hủy và nên sử dụng phương pháp được mô tả sau để kiểm tra thêm chất lượng của RNA.

Hình 2. So sánh RNA bị thoái hóa (làn 2) và RNA nguyên vẹn (làn 3) trên điện di trên gel agarose

03 Máy phân tích sinh học Agilent

Ngoài phương pháp điện di trên gel agarose được mô tả ở trên có thể giúp chúng ta xác định tính toàn vẹn của RNA một cách đơn giản và nhanh chóng, chúng ta cũng có thể sử dụng máy phân tích sinh học Agilent để xác định tính toàn vẹn của RNA.Nó sử dụng sự kết hợp của vi lỏng, điện di mao quản và huỳnh quang để đánh giá nồng độ và tính toàn vẹn của RNA.Bằng cách sử dụng thuật toán tích hợp để phân tích cấu hình của mẫu RNA, máy phân tích sinh học Agilent có thể tính toán giá trị toàn vẹn RNA tham chiếu, Số nguyên vẹn RNA (sau đây gọi là RIN) [1].Giá trị của RIN càng lớn thì tính toàn vẹn của RNA càng cao (1 là cực kỳ suy thoái, 10 là đầy đủ nhất).Một số thí nghiệm liên quan đến RNA đề xuất sử dụng RIN làm tham số để đánh giá chất lượng.Lấy thí nghiệm giải trình tự thông lượng cao (sau đây gọi là NGS) làm ví dụ, hướng dẫn của Oncomine™ Human Immune Repertoire, được sử dụng để phát hiện các thụ thể kháng nguyên tế bào B và tế bào T trong loạt bảng điều khiển Oncomine của Thermo Fisher, đề xuất rằng các mẫu có giá trị RIN lớn hơn 4, Có thể đo được số lần đọc và dòng vô tính hiệu quả hơn (Hình 3).Có các phạm vi được đề xuất khác nhau cho các bảng khác nhau và thường thì RIN cao hơn có thể mang lại dữ liệu hiệu quả hơn.

Hình 3, trong các thí nghiệm Oncomine™ Human Immune Repertoire, các mẫu có RIN lớn hơn 4 có thể phát hiện các lần đọc và các bản sao tế bào T hiệu quả hơn.【2】

Tuy nhiên, giá trị RIN cũng có một số hạn chế.Mặc dù RIN có mối tương quan cao với chất lượng của dữ liệu thử nghiệm NGS, nhưng nó không phù hợp với các mẫu FFPE.Các mẫu FFPE đã được xử lý hóa học trong một thời gian dài và RNA được chiết xuất thường có giá trị RIN tương đối thấp.Tuy nhiên, điều này không có nghĩa là dữ liệu hiệu quả của thí nghiệm phải không đạt yêu cầu.Để đánh giá chính xác chất lượng của các mẫu FFPE, chúng ta cần sử dụng các phép đo khác ngoài RIN.Ngoài RIN, máy phân tích sinh học Agilent cũng có thể tính toán giá trị DV200 như một thông số đánh giá chất lượng RNA.DV200 là thông số tính tỷ lệ các đoạn lớn hơn 200 bp trong một mẫu RNA.DV200 là một chỉ số tốt hơn về chất lượng mẫu FFPE so với RIN.Đối với RNA được chiết xuất bởi FFPE, nó có mối tương quan rất cao với số lượng gen có thể được phát hiện hiệu quả và tính đa dạng của gen [3].Mặc dù DV200 có thể bù đắp những thiếu sót trong việc phát hiện chất lượng của FFPE, nhưng máy phân tích sinh học Agilent vẫn không thể phân tích toàn diện các vấn đề về chất lượng trong các mẫu RNA, bao gồm cả việc liệu có chất ức chế trong mẫu hay không.Bản thân các chất ức chế có thể ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại của các thí nghiệm xuôi dòng và giảm lượng dữ liệu hữu ích.Để biết liệu có chất ức chế trong mẫu hay không, chúng ta có thể áp dụng phương pháp PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực được mô tả tiếp theo.

04 PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực

Phương pháp PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực không chỉ có thể phát hiện các chất ức chế trong mẫu mà còn phản ánh chính xác chất lượng RNA trong mẫu FFPE.So với máy phân tích sinh học Agilent, thiết bị định lượng huỳnh quang thời gian thực phổ biến hơn trong các phòng thí nghiệm sinh học lớn do ứng dụng rộng rãi hơn.Để kiểm tra chất lượng của các mẫu RNA, chúng ta chỉ cần mua hoặc chuẩn bị các đầu dò mồi cho các gen tham chiếu nội bộ, chẳng hạn như GUSB (Mã số Hs00939627).Bằng cách sử dụng bộ mồi, mẫu dò và tiêu chuẩn này (tổng RNA của nồng độ đã biết) để tiến hành các thí nghiệm định lượng tuyệt đối, nồng độ đoạn RNA hiệu quả có thể được tính là tiêu chuẩn đánh giá chất lượng RNA (viết tắt là Định lượng RNA chức năng (FRQ)).Trong một thử nghiệm NGS, chúng tôi thấy rằng FRQ của các mẫu RNA có mối tương quan rất cao với khối lượng dữ liệu hiệu quả.Đối với tất cả các mẫu lớn hơn 0,2ng/uL FRQ, ít nhất 70% số lần đọc có thể bao phủ hiệu quả trình tự tham chiếu (Hình 4).

Hình 4, giá trị FRQ được phát hiện bằng phương pháp định lượng huỳnh quang có mối tương quan rất cao (R2>0,9) với dữ liệu hiệu quả thu được trong thí nghiệm NGS.Đường màu đỏ là giá trị FRQ bằng 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Ngoài việc có thể áp dụng cho các mẫu FFPE, phương pháp PCR định lượng thời gian thực còn có thể theo dõi hiệu quả các chất ức chế trong các mẫu.Chúng ta có thể thêm mẫu cần phát hiện vào hệ thống phản ứng với Kiểm soát dương tính bên trong (IPC) và Xét nghiệm của nó, sau đó thực hiện định lượng huỳnh quang để thu được giá trị Ct.Nếu giá trị Ct thấp hơn giá trị Ct trong phản ứng không có mẫu, điều đó cho thấy chất ức chế có mặt trong mẫu và ức chế hiệu quả khuếch đại trong phản ứng.

05 Phương pháp nhuộm huỳnh quang Qubit

Máy đo huỳnh quang Qubit là thiết bị nhỏ được sử dụng phổ biến nhất để phát hiện nồng độ và độ tinh khiết của axit nucleic, dễ vận hành và tồn tại ở hầu hết mọi phòng thí nghiệm sinh học phân tử.Nó tính toán chính xác nồng độ axit nucleic bằng cách phát hiện và thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết axit nucleic (thuốc thử phát hiện Qubit).Qubit có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời có thể định lượng RNA chính xác đến nồng độ pg/µL.Ngoài khả năng nổi tiếng là định lượng chính xác nồng độ axit nucleic, mẫu mới nhất của Thermo Fisher, Qubit 4.0, còn có thể phát hiện tính toàn vẹn của RNA.Hệ thống phát hiện RNA của Qubit 4.0 (Xét nghiệm IQ RNA) phát hiện tính toàn vẹn của RNA bằng cách phát hiện đồng thời hai loại thuốc nhuộm huỳnh quang cụ thể.Hai loại thuốc nhuộm huỳnh quang này có thể liên kết với các đoạn RNA lớn và các đoạn RNA nhỏ tương ứng.Hai thuốc nhuộm huỳnh quang này cho biết tỷ lệ các đoạn RNA lớn trong mẫu và từ đó có thể tính được giá trị IQ (Tính toàn vẹn và Chất lượng) đại diện cho chất lượng RNA.Giá trị IQ được áp dụng cho cả mẫu FFPE và không phải FFPE và có ảnh hưởng lớn đến chất lượng giải trình tự tiếp theo.Lấy thí nghiệm NGS làm ví dụ, trong các thí nghiệm kiểm tra RNA-Seq được thực hiện trên nền tảng Ion torrent™, hầu hết các mẫu có giá trị IQ lớn hơn 4 đều có ít nhất 50% số lần đọc hiệu quả (Hình 5).So với các phương pháp phát hiện nêu trên, Qubit IQ Assay không chỉ vận hành thuận tiện hơn và tốn ít thời gian hơn (trong vòng năm phút) mà còn có mối tương quan lớn giữa giá trị IQ tham số đo được và chất lượng dữ liệu của các thử nghiệm tiếp theo.

Trong Hình 5, có một mối tương quan lớn giữa giá trị Qubit RNA IQ và các lần đọc RNA-Seq được ánh xạ.【5】

Thông qua phần giới thiệu trên, tôi tin rằng mọi người đã có đủ hiểu biết về các phương pháp kiểm soát chất lượng RNA khác nhau.Trong thực tế, bạn có thể chọnphương pháp tương ứng theo loại mẫu và dụng cụ hiện có.Chỉ bằng cách kiểm soát tốt chất lượng RNA, chúng ta mới có thể tránh được sự thất bại của các thí nghiệm tiếp theo do chất lượng mẫu kém, do đó tiết kiệm được thời gian, năng lượng và chi phí quý giá.

Sản phẩm tham khảo:

Bộ phân lập RNA tổng số động vật

Bộ phân lập RNA tổng số tế bào

người giới thiệu

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: số toàn vẹn RNA để gán các giá trị toàn vẹn cho các phép đo RNA.BMC phân tử Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Hướng dẫn sử dụng tiết mục miễn dịch con người trực tuyến (Số xuất bản MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Các chỉ số đo lường chất lượng nâng cao để đánh giá RNA có nguồn gốc từ các mẫu mô nhúng parafin cố định bằng formalin, Khoa học độc chất, Tập 170, Số 2, tháng 8 năm 2019, Trang 357–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/