Chúng tôi đã được nhà sản xuất có kinh nghiệm.Giành được đa số trong các chứng nhận quan trọng của thị trường đối với Chiết khấu lớn Máy thăm dò một bước có độ nhạy cao của Trung Quốc Rt-QpcrBộ công cụ V2, Chất lượng là cuộc sống của nhà máy, Tập trung vào nhu cầu của khách hàng là nguồn gốc của sự tồn tại và phát triển của công ty, Chúng tôi tuân thủ thái độ làm việc trung thực và thiện chí, mong bạn đến!
Chúng tôi đã được nhà sản xuất có kinh nghiệm.Giành được phần lớn trong các chứng chỉ quan trọng của thị trường choTrung Quốc Taq DNA polymerase, Qpcr, Công ty chúng tôi hứa hẹn: giá cả hợp lý, thời gian sản xuất ngắn và dịch vụ hậu mãi thỏa đáng, chúng tôi cũng chào đón bạn đến thăm nhà máy của chúng tôi bất cứ lúc nào bạn muốn.Chúc bây giờ chúng ta có một công việc kinh doanh thú vị và lâu dài cùng nhau!!!

mô tả

Bộ kit này sử dụng một hệ thống đệm ly giải độc đáo có thể nhanh chóng giải phóng RNA từ các mẫu tế bào nuôi cấy cho các phản ứng RT-qPCR, do đó loại bỏ quá trình tinh chế RNA tốn nhiều thời gian và công sức.Mẫu RNA có thể được lấy chỉ trong 7 phút.Thuốc thử 5×Direct RT Mix và 2×Direct qPCR Mix-SYBR được cung cấp bởi bộ công cụ này có thể thu được kết quả PCR định lượng theo thời gian thực một cách nhanh chóng và hiệu quả.

5×Direct RT Mix và 2×Direct qPCR Mix-SYBR có khả năng chịu chất ức chế mạnh và dịch ly giải của các mẫu có thể được sử dụng trực tiếp làm khuôn mẫu cho RT-qPCR.Bộ kit này chứa enzyme phiên mã ngược Foregene có ái lực cao RNA độc đáo và Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, đệm phản ứng, chất tối ưu hóa PCR và chất ổn định.

thông số kỹ thuật

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

thành phần bộ

Tính năng & ưu điểm

■ Đơn giản và hiệu quả : với công nghệ Cell Direct RT, mẫu RNA có thể được lấy chỉ trong 7 phút.

■ Nhu cầu mẫu nhỏ, chỉ có thể thử nghiệm 10 ô.

■ Thông lượng cao: nó có thể nhanh chóng phát hiện RNA trong các tế bào được nuôi cấy trong các đĩa 384, 96, 24, 12, 6 giếng.

■ DNA Eraser có thể nhanh chóng loại bỏ các bộ gen được giải phóng, giúp giảm đáng kể tác động đến các kết quả thí nghiệm tiếp theo.

■ Hệ thống RT và qPCR được tối ưu hóa giúp sao chép ngược RT-PCR hai bước hiệu quả hơn và PCR đặc hiệu hơn, đồng thời chống lại các chất ức chế phản ứng RT-qPCR tốt hơn.

ứng dụng bộ

Phạm vi áp dụng: nuôi cấy tế bào.

- RNA được giải phóng khi ly giải mẫu: chỉ áp dụng cho mẫu RT-qPCR của bộ kit này.

- Bộ kit có thể được sử dụng cho các mục đích sau: phân tích biểu hiện gen, xác minh tác dụng làm im lặng gen qua trung gian siRNA, sàng lọc thuốc, v.v.

Biểu đồ

Lưu trữ và thời hạn sử dụng

Phần I của bộ này nên được bảo quản ở 4℃;Phần II nên được bảo quản ở -20℃.

Foregene Protease Plus II nên được bảo quản ở 4℃, không đóng băng ở -20℃.

Thuốc thử 2×Direct qPCR Mix-SYBR nên được bảo quản ở -20℃ trong bóng tối;nếu được sử dụng thường xuyên, nó cũng có thể được bảo quản ở nhiệt độ 4℃ để bảo quản trong thời gian ngắn (sử dụng hết trong vòng 10 ngày). Chúng tôi là nhà sản xuất có kinh nghiệm.Giành được phần lớn trong các chứng nhận quan trọng của thị trường đối với Bộ công cụ thăm dò một bước Rt-Qpcr V2 có độ nhạy cao của Trung Quốc chiết khấu lớn, Chất lượng là cuộc sống của nhà máy, Tập trung vào nhu cầu của khách hàng là nguồn gốc của sự tồn tại và phát triển của công ty, Chúng tôi tuân thủ thái độ làm việc trung thực và thiện chí, mong bạn đến!
chiết khấu lớnTrung Quốc Taq DNA polymerase, Qpcr, Công ty chúng tôi hứa hẹn: giá cả hợp lý, thời gian sản xuất ngắn và dịch vụ hậu mãi thỏa đáng, chúng tôi cũng chào đón bạn đến thăm nhà máy của chúng tôi bất cứ lúc nào bạn muốn.Chúc bây giờ chúng ta có một công việc kinh doanh thú vị và lâu dài cùng nhau!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Đối với RT-qPCR trực tiếp trên tế bào sử dụng ≤ 1000.000 tế bào

Giơi thiệu sản phẩm

Sản phẩm này sử dụng hệ thống đệm ly giải độc đáo để nhanh chóng giải phóng RNA từ các mẫu tế bào nuôi cấy cho các phản ứng RT-qPCR, loại bỏ quy trình tinh chế RNA tốn nhiều thời gian và công sức, đồng thời chỉ mất 7 phút để thu được mẫu RNA cần thiết, với 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman do bộ công cụ cung cấp có thể thu được kết quả PCR định lượng theo thời gian thực một cách nhanh chóng và hiệu quả.

5× Direct RT Mix và 2× Direct qPCR Mix-Taqman có khả năng chịu đựng chất ức chế mạnh và có thể thực hiện đảo ngược hiệu quả và khuếch đại cụ thể bằng cách sử dụng dịch ly giải của mẫu được đo làm mẫu.Thuốc thử chứa Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Bộ đệm phản ứng, Bộ tối ưu hóa và Bộ ổn định PCR, có thể được sử dụng với bộ đệm ly giải để phát hiện mẫu nhanh chóng và dễ dàng, đồng thời có các đặc tính về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định cao.

tính năng sản phẩm

Công nghệ Cell Direct RT đơn giản, hiệu quả chỉ mất ít nhất 7 phút để lấy mẫu RNA.

Yêu cầu mẫu nhỏ và có thể sử dụng tối thiểu 10 tế bào nuôi cấy để thử nghiệm.

Thông lượng cao để thu nhận RNA nhanh chóng của các tế bào nuôi cấy như các đĩa 384, 96, 24, 12 và 6 giếng.

DNA Eraser có thể nhanh chóng loại bỏ các bộ gen được giải phóng, giúp giảm đáng kể tác động đến các kết quả thí nghiệm tiếp theo.

Các hệ thống RT và qPCR được tối ưu hóa cho phép RT-PCR hai bước với khả năng sao chép ngược hiệu quả hơn, tính đặc hiệu và khả năng chịu đựng chất ức chế phản ứng RT-qPCR mạnh hơn.

ứng dụng bộ

Phạm vi áp dụng: Nuôi cấy tế bào.

Ly giải mẫu RNA được giải thích: chỉ được sử dụng làm mẫu RT-qPCR hai bước.

Bộ dụng cụ có thể được sử dụng cho các mục đích sau: phân tích biểu hiện quy định gen, xét nghiệm alen, sàng lọc thuốc, v.v.

giới hạn bộ

Các đoạn khuếch đại ≤ 300 bp.

Bộ dụng cụ được sử dụng để nuôi cấy tế bào mới.

kiểm soát chất lượng sản phẩm

Theo Hệ thống quản lý chất lượng toàn diện của FOREGENE, mỗi lô bộ kit Cell Direct RT-qPCR được kiểm tra nghiêm ngặt nhiều lần để đảm bảo độ tin cậy và ổn định về chất lượng của từng lô bộ kit.

Nội dung lắp ráp

*:Ly giải tế bào, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman có thể được mua riêng, chi tiết được cung cấp trong Phụ lục 1 (TRANG 13).

Điều kiện bảo quản

1. Điều kiện vận chuyển

Toàn bộ quá trình vận chuyển hộp đá ở nhiệt độ thấp, để đảm bảo rằng bộ dụng cụ ở trạng thái <4 °C.

2. Điều kiện bảo quản

Bảo quản Phần I ở 4°C và Phần II ở -20°C.

Foregene Protease Plus II nên được bảo quản ở nhiệt độ 4°C, không được đông lạnh ở -20°C.

Thuốc thử 2× Direct qPCR Mix-Taqman được bảo quản ở -20°C hoặc ở 4°C để sử dụng trong thời gian ngắn nếu được sử dụng thường xuyên (trong vòng 10 ngày).

Thông tin thành phần bộ

Đệm CL: Cung cấp môi trường cần thiết cho các phản ứng ly giải tế bào.

Bộ đệm ST: Chấm dứt hoạt chất trong dịch ly giải để tránh ảnh hưởng đến RT tiếp theo.

DNA Eraser: chất tẩy DNA, tác dụng loại bỏ bộ gen đối với các thí nghiệm tiếp theo.

Hỗn hợp RT trực tiếp 5×: Chứa Foregene Reverse Transcriptase có ái lực RNA cao, Chất ức chế RNase, dNTP, chất ổn định, chất tăng cường, chất tối ưu hóa và đoạn mồi phiên mã ngược để liên kết tối ưu (Mồi ngẫu nhiên, Oligo(dT)₁₈Lót).

Foregene Protease Plus II: Trong bối cảnh dung dịch đệm ly giải, các tế bào bị ly giải để giải phóng axit nucleic.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Thuốc thử này chứa Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, đệm phản ứng, chất tối ưu hóa PCR và chất ổn định.

20× ROX Reference Dye: Thường được sử dụng trên các thiết bị khuếch đại Real Time PCR của ABI, Stratagene và các công ty khác, nó được sử dụng để điều chỉnh sự khác biệt giữa các ống PCR và các ống do lỗi định lượng PCR gây ra.Nồng độ Thuốc nhuộm tham chiếu ROX 20× cần thiết cho các thiết bị khác nhau là khác nhau và người dùng có thể thêm nó theo nồng độ khuyến nghị của thiết bị.

ddH không có RNase₂O: Nước siêu tinh khiết đã khử trùng không chứa RNase cho phản ứng RT-qPCR hai bước.

Các biện pháp phòng ngừa:(Hãy chắc chắn đọc các biện pháp phòng ngừa cẩn thận trước khi sử dụng bộ sản phẩm)

Chú ý cách thức thao tác thí nghiệm để tránh lây nhiễm chéo giữa các mẫu.

Chú ý vệ sinh môi trường và dụng cụ thí nghiệm để tránh nhiễm RNAse và phân hủy RNA.

Lấy các mẫu tế bào tươi hoặc được bảo quản tốt và không bao giờ sử dụng lặp lại các mẫu tế bào đã được làm đông lạnh.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman nên tránh làm đông-rã đông lặp đi lặp lại, nếu không nó sẽ ảnh hưởng đến phiên mã ngược và hiệu quả PCR.

chuẩn bịkhẩu phần ăntrướchoạt động

Đảm bảo đọc kỹ hướng dẫn trước khi sử dụng bộ công cụ này.Cell Direct RT-qPCR Kit vận hành đơn giản, thuận tiện và nhanh chóng, đồng thời hướng dẫn cung cấp thông tin đầy đủ về toàn bộ bộ kit cũng như cách sử dụng đúng cách.Vui lòng chuẩn bị các vật liệu và thiết bị thí nghiệm cần thiết trước khi sử dụng.

Vật liệu và thiết bị thí nghiệm

◆ Nuôi cấy tế bào.

◆ 1,5 ml hoặc 2 ml, ống ly tâm RNase-/DNase-Free, đầu tip RNase-/DNase-Free, ống qPCR vô trùng 0,2 ml.

◆ máy qPCR, pipet, máy ly tâm để bàn (≥13.400×g) (tùy thuộc vào nhu cầu thí nghiệm), v.v.

Sự an toàn

◆ Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu khoa học, vui lòng không sử dụng cho mục đích dược phẩm, lâm sàng, thực phẩm và mỹ phẩm.

◆ Khi sử dụng hóa chất phải mặc quần áo phòng thí nghiệm phù hợp, đeo găng tay, kính bảo hộ, v.v.

Hoạt độnghướng dẫn

Bạn có thể mua riêng các gói bổ sung dung dịch phản ứng qPCR, hệ thống Ly giải tế bào, hệ thống RT và gói bổ sung dung dịch phản ứng qPCR, để biết chi tiết trong Phụ lục 1 (TRANG 13).

hướng dẫn vận hành

A: Giải phóng RNA mẫu

1. Tế bào đã được xử lý trước: Rửa đĩa nuôi cấy tế bào bằng PBS lạnh, sau đó ly giải tế bào (10-10⁶), 10⁶ hơn số lượng tế bào, nên dùng Foregene the Cell and RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) hoặc Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) để tách chiết và tinh sạch RNA.

1.1.Tế bào kết dính (ví dụ đĩa 24 giếng)

1.1.1.Xác định số lượng tế bào trong mỗi giếng, xác định rằng số lượng tế bào là 1 × 10⁵, và dùng pipet để lấy môi trường nuôi cấy ra khỏi đĩa nuôi cấy.

1.1.2.Thêm 200 μl 1 × PBS đã được làm lạnh trước vào mỗi giếng.Không dùng pipet lặp lại và loại bỏ PBS khỏi giếng.Nghiêng tấm và loại bỏ càng nhiều PBS càng tốt.Tiến hành bước 2.

1.1.3.Đĩa nuôi cấy tế bào khác hoặc bảng số tham chiếu 1-1 trong đĩa nuôi cấy tế bào đã được thêm 1 × PBS đã được làm lạnh trước để rửa tế bào.

Bảng 1-1: Liều lượng PBS cho số lượng tế bào khác nhau

Ghi chú：Để đảm bảo một tế bào kết dính vững chắc，một lượng lớn tế bào bị mất khi rửa.

1.2.Tế bào huyền phù hoặc tế bào dính được nuôi cấy trong đĩa không xốp

1.2.1.Các tế bào kết dính được nuôi cấy trong đĩa không đa giếng (tế bào huyền phù bắt đầu từ bước tiếp theo 1.2.2), thu thập và tách các tế bào theo phương pháp thu thập tế bào thông thường rồi đặt chúng vào đĩa nuôi cấy hoặc ống ly tâm;nếu sử dụng quá trình trypsin hóa, yêu cầu ly tâm để thu thập các tế bào và loại bỏ trypsin còn sót lại, thêm các tế bào được tái tạo huyền phù PBS vào các tế bào riêng lẻ để phân tán các tế bào.

1.2.2.Sau khi số lượng ô được đếm, các ô được chia thành 1 × 10⁵ một vào các ống ly tâm, thu thập các tế bào bằng cách ly tâm ở 1000 × g trong 10 phút.

1.2.3.Thêm 200 μl PBS vào ống ly tâm, không dùng pipet lặp lại và hút trực tiếp PBS.tiến hành bước 2. (Nếu khó kết tủa và tế bào lại được huyền phù lại, có thể thực hiện ly tâm 1000×g 10 phút sau khi loại bỏ phần nổi phía trên, viên tế bào tiến hành bước 2)

2. Ly giải tế bào: Loại bỏ Buffer CL, nhiệt độ của nó được cân bằng với nhiệt độ phòng, DNA Eraser và Foregene Protease Plus II, theo hệ thống ly giải đã chuẩn bị sẵn trong bảng 1-2 sau đây: (Dung dịch ly giải đã sẵn sàng để sử dụng).

Bảng1-2: sự phân cắt chuẩn bị hệ thống (Lưu ý: trong quá trình chuẩn bị trên băng)

3.( Ví dụ về đĩa 24 giếng) Dùng pipet hút 200 μl dung dịch gốc ly giải tế bào trộn đều vào từng giếng, Thổi liên tục 5-10 lần, Ủ ở nhiệt độ phòng (20-25 ℃) trong 5 phút.

Ghi chú：Để tránh hình thành bong bóng, vui lòng điều chỉnh thang đo pipette khi pipet được điều chỉnh thành 200μl hoặc ít hơn.Các tế bào có thể xuất hiện nhiều mây sau khi ly giải, điều này là bình thường.

4. (Ví dụ: tấm 24 giếng) được thêm vào trong 20 μl dung dịch đệm ST lỏng (các hệ thống ly giải khác nhau Buffer ST được thêm vào với lượng như trong Bảng 1-3), hút lặp lại 5-10 lần, ở nhiệt độ phòng (20-25 ℃) được ủ trong 2 phút.

Ghi chú：Đầu pipet được bố trí bên dưới bề mặt, đảm bảo rằng dịch ly giải được thêm vào，để tránh hình thành bong bóng, vui lòng điều chỉnh thang đo pipette khi pipet được điều chỉnh thành 200μl hoặc ít hơn.

Bảng 1-3：Thêm bộ đệm ST

5. Lysate được sử dụng cho các thử nghiệm RT-qPCR tiếp theo.Nếu các thí nghiệm tiếp theo không thể được thực hiện kịp thời, vui lòng giữ nó trên đá không quá 2 giờ và bảo quản ở -20℃ hoặc -80℃ (không quá ba tháng).

B: Chuẩn bị hệ thống RT

1. Lấy 5 × Direct RT Mix ra và đặt lên chậu nước đá, để tan chảy tự nhiên rồi trộn nhẹ để sử dụng sau;lấy ra RNase-Free ddH2O và làm tan chảy nó và đặt nó vào một bể nước đá để sử dụng sau.Chuẩn bị hệ thống phản ứng trên nước đá theo bảng 2-1 dưới đây.

Bảng 2-1: Chuẩn bị hệ thống phản ứng RT

2.Sau khi hoàn thành công thức hệ thống, nhẹ nhàng trộn và ly tâm một thời gian ngắn trong bảng 2 -2 điều kiện phản ứng sau Phản ứng RT.

Bảng 2-2: RT Cài đặt điều kiện phản ứng

3. Sau khi hoàn thành phản ứng, sản phẩm phản ứng được đặt trực tiếp trên băng cho qPCR, vui lòng bảo quản lâu dài -20℃ hoặc -80℃.

Lưu ý: Do sử dụng tiêu bản chưa được tinh sạch nên trong sản phẩm phiên mã ngược có thể xuất hiện kết tủa trắng.Đây là một hiện tượng bình thường.Ly tâm ngay dịch nổi cho các thí nghiệm tiếp theo.

Dung dịch phản ứng RT thu được được thêm vào hệ thống phản ứng Step Real Time PCR tiếp theo, nên thêm lượng từ 10-30% của hệ thống phản ứng.

C: chuẩn bị hệ thống phản ứng qPCR

1. Lượng B thích hợp chuẩn bị trong bước cDNA template theo bảng 3-1 sau để chuẩn bị hệ thống phản ứng.

Lưu ý: Lượng cDNA template chiếm 10-30% trong hệ thống qPCR.Ví dụ: trong hệ thống qPCR 20μl, hãy thêm 2-6 μl dung dịch đệm ly giải, nhưng không nhiều hơn 6 μl.

2. Tối ưu hóa các điều kiện qPCR tốt (Nhiệt độ ủ, v.v.) cho phản ứng qPCR (Các điều kiện phản ứng được đưa ra trong Bảng 3-2).

Lưu ý: Cố gắng sử dụng các điều kiện được tối ưu hóa cho các phản ứng qPCR để có kết quả tốt hơn.

Bảng 3-1: Chuẩn bị hệ thống phản ứng PCR

1*: Có thể điều chỉnh nồng độ mồi trong khoảng 50-900 nM khi hiệu suất phản ứng mồi kém.

Lưu ý: Hệ thống qPCR có thể được điều chỉnh theo nhu cầu thí nghiệm và mô hình chu kỳ huỳnh quang.Đối với qPCR trong 50μl hệ thống, điều chỉnh liều lượng thuốc thử theo tỷ lệ 20μtôi hệ thống.

2*: Chọn nồng độ cuối cùng thích hợp của ROX Reference Dye theo máy chu trình nhiệt định lượng huỳnh quang.Nồng độ Thuốc nhuộm tham chiếu ROX thích hợp nhất cho các chu trình định lượng huỳnh quang thông thường được trình bày trong bảng dưới đây:

Bảng 3-2: Điều kiện phản ứng qPCR được cung cấp

Lưu ý: Để đạt được hiệu quả qPCR tốt nhất, PCR gradient có thể được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cho các mẫu khác nhau và các đoạn mồi khác nhau.Các điều kiện phản ứng PCR khác nhau tùy thuộc vào máy phân tích huỳnh quang, khuôn mẫu, mồi, v.v. Trong hoạt động cụ thể, các điều kiện phản ứng tối ưu cần được thiết kế theo các điều kiện cụ thể của máy luân nhiệt định lượng huỳnh quang, loại khuôn mẫu, kích thước của đoạn quan tâm, trình tự cơ sở của đoạn được khuếch đại và hàm lượng GC và độ dài của mồi, bao gồm nhiệt độ ủ, thời gian phản ứng, v.v.

Nguyên tắc thiết kế mồi Real Time PCR

Sơn lót xuôi và sơn lót ngược

Đối với Real Time PCR, thiết kế mồi rất quan trọng.Các đoạn mồi liên quan đến tính đặc hiệu và hiệu quả của quá trình khuếch đại PCR và có thể được thiết kế dựa trên các nguyên tắc sau:

◆ Chiều dài mồi: 18-30bp.

◆ Hàm lượng GC: 40-60%.

◆ Giá trị Tm: Phần mềm thiết kế mồi, chẳng hạn như Primer 5, có thể đưa ra giá trị Tm của mồi.Các giá trị Tm của đoạn mồi ngược dòng và xuôi dòng phải càng gần càng tốt.Công thức tính Tm cũng có thể được sử dụng: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Khi thực hiện PCR, nhiệt độ dưới giá trị Tm mồi là 5 °C thường được chọn làm nhiệt độ ủ (sự gia tăng tương ứng của nhiệt độ ủ có thể làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng PCR).

◆ Mồi và sản phẩm PCR:

◆ Thiết kế độ dài sản phẩm khuếch đại PCR mồi tốt nhất là 100-150bp.

◆ Nên tránh sơn lót thiết kế trong khu vực cấu trúc thứ cấp của mẫu càng nhiều càng tốt.

◆ Tránh hình thành 2 hoặc nhiều bazơ bổ sung giữa 3′ đầu của mồi ngược dòng và xuôi dòng.

◆ Đế đầu cuối mồi 3′ không thể xuất hiện với 3 G hoặc C liên tiếp bổ sung.

◆ Bản thân mồi không được có cấu trúc bổ sung, nếu không sẽ hình thành cấu trúc kẹp tóc, ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại PCR.

◆ ATCG nên được phân phối càng đồng đều càng tốt trong trình tự mồi và nên tránh cơ sở đầu cuối 3′ là T.

ruột thừa1：Ctrực tiếpRT-qPCR bộ thành phầngói bổ sung t

1.Giải pháp ly giải tế bào