Thí nghiệm RT-qPCR bao gồm trích xuất RNA và đánh giá chất lượng, phiên mã ngược và qPCR ba bước, mỗi bước có rất nhiều lưu ý, chúng tôi sẽ giới thiệu chi tiết bên dưới.

Ⅰ.đánh giá chất lượng RNA

Trong thí nghiệm RT-qPCR, sau khi hoàn thành quá trình chiết xuất RNA, chất lượng của RNA cần được đánh giá và chỉ có thể thực hiện các thí nghiệm tiếp theo sau khi đủ tiêu chuẩn.Các phương pháp đánh giá bao gồm máy đo quang phổ, điện di trên gel Agilent, phân tích Agilent 2100, trong đó máy đo quang phổ được sử dụng phổ biến nhất và phát hiện phương pháp điện di trên gel agarose.Cần lưu ý rằng hai phương pháp này cần được sử dụng cùng nhau để hoàn thành việc phát hiện và phân tích nồng độ, độ tinh khiết và tính toàn vẹn của RNA, nhằm đảm bảo chất lượng của RNA.

Bộ phân lập RNA liên quan: 

Bộ phân lập RNA tổng số tế bào

Có thể thu được RNA tổng số chất lượng cao và tinh khiết cao từ các tế bào nuôi cấy khác nhau trong 11 phút.

Bộ phân lập RNA tổng số động vật

Trích xuất nhanh chóng và hiệu quả RNA tổng số có độ tinh khiết cao và chất lượng cao từ các mô động vật khác nhau.

Máy quang phổ:

Máy đo quang phổ chủ yếu được sử dụng để xác định nồng độ và độ tinh khiết của RNA, nhưng nó không thể phát hiện tính toàn vẹn của RNA và dư lượng bộ gen.Trong số đó, A260/280 và A260/230 là các thông số quan trọng để phát hiện độ tinh khiết của RNA và độ tinh khiết của RNA có thể được phát hiện theo sự dao động của các giá trị của chúng:

1. 1,9< A260/280< 2,1, cho thấy độ tinh khiết của RNA là tốt;A260/280<1,9, chỉ ra rằng có thể có dư lượng protein trong RNA;A260/280>2.1, cho thấy có thể phân hủy một phần RNA, điều này có thể được xác nhận thêm bằng điện di trên gel agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, cho thấy độ tinh khiết của RNA là tốt;A260/230< 2.0, chỉ ra rằng có thể có dư lượng thuốc thử hữu cơ trong RNA, chẳng hạn như phenol, ethanol hoặc đường.

Điện di trên gel agarose:

Xét nghiệm điện di trên gel agarose có thể phân tích tính toàn vẹn của RNA, dư lượng bộ gen và protein, nhưng không thể định lượng chính xác nồng độ RNA hoặc phát hiện dư lượng của thuốc thử hữu cơ.Lấy mẫu RNA eukaryote làm ví dụ:

1. RNA được điện di trên gel agarose.Nếu chỉ có ba dải đơn 28sRNA, 18sRNA và 5,8sRNA trên bản đồ gel, thì điều đó cho thấy rằng RNA được chiết xuất còn nguyên vẹn.Nếu có hiện tượng kéo lê chứng tỏ RNA đã bị thoái hóa một phần.

2. Nếu có một dải sáng duy nhất giữa lỗ keo và dải 28sRNA, thì có thể có dư lượng DNA bộ gen.

3. Nếu các dải xuất hiện trong lỗ keo, điều đó cho thấy có thể có cặn protein và các chất cao phân tử khác.

Ⅱ. Phiên mã ngược

Sau khi tách chiết RNA hoàn tất, nó cần được đảo ngược thành cDNA cho các thí nghiệm tiếp theo, vì vậy bước đảo ngược là rất cần thiết.Phiên mã ngược sẽ được đưa vào từ quá trình lựa chọn enzyme phiên mã ngược và đoạn mồi:

Lựa chọn phiên mã ngược:

Các phiên mã ngược điển hình bao gồm AMV RTase và MMLV RTase.RNase H của AMV RTase có hoạt tính mạnh, thời gian tổng hợp ngắn, lượng tổng hợp thấp và ổn định nhiệt tốt (42 ~ 55℃).Hoạt tính RNase H của MMLV RTase yếu, thời gian tổng hợp dài, lượng tổng hợp cao và độ ổn định nhiệt kém (37 ~ 42℃).

Do enzyme RNase H có chức năng làm suy giảm khuôn mẫu RNA, nên MMLV có hoạt tính RNase H yếu nên được ưu tiên lựa chọn trong quá trình sao chép ngược và sau kỹ thuật di truyền sau này, độ ổn định nhiệt của MMLV đã đạt đến một bước nhảy vọt về chất.lấy tiền thânForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV để sao chép ngược) ví dụ, đó là một enzym phiên mã ngược mới được biểu hiện ở vi khuẩn E. coli được biến đổi gen bằng công nghệ tái tổ hợp gen.Đó là một DNA polymerase tái tổ hợp tổng hợp chuỗi DNA bổ sung từ RNA, DNA chuỗi đơn hoặc RNA:DNA lai.Nó không có hoạt động RNase H, ổn định mạnh, ái lực mạnh với RNA và độ nhạy phát hiện cao.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV để sao chép ngược)

Lựa chọn sơn lót:

Nói chung mồi RT được chia thành ba loại: oligo dT, mồi ngẫu nhiên và mồi đặc hiệu cho gen.Chọn mồi phù hợp để sử dụng theo các yêu cầu thí nghiệm khác nhau.

1. Nếu khuôn mẫu có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn và cDNA muộn được sử dụng để khuếch đại PCR thông thường, nên sử dụng Oligo (dT);Nếu thí nghiệm tiếp theo chỉ được sử dụng cho qPCR, nên trộn Oligo (dT) với các đoạn mồi ngẫu nhiên để cải thiện hiệu quả của phiên mã ngược.

2. Nếu khuôn mẫu là từ sinh vật nhân sơ thì chọn Mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu của gen để phiên mã ngược.

Ⅲ.qPCR

Định lượng huỳnh quang chủ yếu được xây dựng từ việc lựa chọn phương pháp định lượng, nguyên tắc thiết kế mồi, lựa chọn ROX, cấu hình hệ thống phản ứng và cài đặt điều kiện phản ứng, v.v.

Lựa chọn phương pháp định lượng:

Phương pháp định lượng được chia thành phương pháp định lượng tương đối và phương pháp định lượng tuyệt đối.Định lượng tương đối có thể được sử dụng để phát hiện tác động của một số phương pháp điều trị đối với biểu hiện gen, phát hiện sự khác biệt của biểu hiện gen tại các thời điểm khác nhau và so sánh sự khác biệt của biểu hiện gen trong các mô khác nhau.Định lượng tuyệt đối có thể phát hiện lượng axit nucleic trong virus, v.v.Khi làm thí nghiệm phải lựa chọn các phương pháp định lượng phù hợp theo thực nghiệm của bản thân.

Nguyên tắc thiết kế mồi:

Việc thiết kế mồi cho qPCR có liên quan trực tiếp đến hiệu quả khuếch đại và tính đặc hiệu của sản phẩm.Do đó, thiết kế chính xác các đoạn mồi tốt là bước đầu tiên của quá trình qPCR thành công.Khi thiết kế sơn lót cần chú ý các nguyên tắc sau khi đáp ứng nguyên tắc thiết kế sơn lót thông thường:

1. Độ dài của đoạn mục tiêu được kiểm soát trong khoảng từ 100 đến 300 bp;

2. Thiết kế exon chéo để tránh ảnh hưởng của DNA bộ gen;

3. Các mồi đã thiết kế cần phải được kiểm tra hiệu suất khuếch đại và chỉ khi hiệu suất khuếch đại đạt tiêu chuẩn (90-110%) mới được sử dụng cho các thí nghiệm định lượng;

4. Nồng độ mồi thường được tối ưu hóa trong khoảng từ 0,1uM đến 1,0uM.

Sự lựa chọn củaROX:

Trong quá trình phản ứng định lượng, ROX có thể điều chỉnh đồng nhất chênh lệch đường quang, lỗi pipet hoặc chênh lệch thể tích do bay hơi và ngưng tụ, cải thiện độ lặp lại của kết quả.Tuy nhiên, cần lưu ý rằng việc lựa chọn ROX có liên quan đến nhạc cụ.Nếu thiết bị qPCR có chức năng tự động điều chỉnh sự khác biệt giữa các lỗ, thì không cần thêm ROX;nếu không, nó cần thêm hiệu chỉnh ROX.Các tiểu thương khi mua thuốc thử phải căn cứ theo dụng cụ sử dụng để chọn đúng ROX, tránh nhầm lẫn về sau.

Chuẩn bị hệ thống phản ứng:

Thể tích phản ứng 20ul và 50ul được ưu tiên.Các vấn đề sau cần được chú ý khi xây dựng hệ thống:

1. Hệ thống phản ứng cần được chuẩn bị bằng cách thông gió trong bàn làm việc siêu sạch, ddH mới₂O được sử dụng cho mỗi thí nghiệm;

2. Mỗi thí nghiệm cần chuẩn bị NTC để xác minh xem có ô nhiễm trong hệ thống hay không và mỗi cặp mồi cần thực hiện NTC khi chuẩn bị hệ thống;

3. Để phát hiện xem có dư lượng gDNA trong mẫu RNA hay không, NRT có thể được chuẩn bị cho từng mẫu để phát hiện;

4. Khi chuẩn bị hệ thống, nên thực hiện ít nhất 3 lần lặp lại kỹ thuật cho một mẫu;

5. Khi template là cDNA, nên pha loãng 5-10 lần để giảm tác dụng ức chế hệ phiên mã ngược trên thí nghiệm qPCR.Tốt hơn là khám phá số lượng mẫu theo độ dốc, để giá trị CT nằm trong khoảng 20-30;

6. Xác định số lượng phản ứng cần thiết, tăng 5-10% trên cơ sở số lượng phản ứng và tính toán số cấu hình thể tích;

7, hệ thống được chuẩn bị theo nguyên tắc trộn sẵn, trộn sau khi ly tâm và đảm bảo không có bọt khí;

8, Càng nhiều càng tốt để chọn hàng tiêu dùng hỗ trợ.

Bộ RT-qPCR liên quan