PCR định lượng huỳnh quang (còn được gọi là TaqMan PCR, sau đây gọi tắt là FQ-PCR) là một công nghệ định lượng axit nucleic mới được phát triển bởi PE (Perkin Elmer) tại Hoa Kỳ vào năm 1995. Công nghệ này dựa trên PCR thông thường bằng cách bổ sung các mẫu dò có dán nhãn huỳnh quang.So với PCR linh hoạt, FQ-PCR có nhiều ưu điểm để thực hiện chức năng định lượng của nó.Bài viết này dự định mô tả ngắn gọn các đặc điểm, nguyên tắc, phương pháp và ứng dụng của công nghệ.
1 Tính năng
FQ-PCR không chỉ có độ nhạy cao của PCR thông thường mà còn do ứng dụng đầu dò huỳnh quang nên có thể phát hiện trực tiếp sự thay đổi của tín hiệu huỳnh quang trong quá trình khuếch đại PCR thông qua hệ thống dẫn quang điện để thu được kết quả định lượng, khắc phục được nhiều nhược điểm của PCR thông thường nên nó cũng có tính đặc hiệu cao của lai ghép DNA và độ chính xác cao của công nghệ quang phổ.
Ví dụ, các sản phẩm PCR nói chung cần được quan sát bằng điện di trên gel agarose và nhuộm ethidium bromide bằng tia cực tím hoặc bằng điện di trên gel polyacrylamide và nhuộm bạc.Điều này không chỉ đòi hỏi nhiều công cụ, mà còn tốn thời gian và công sức.Các vết bẩn được sử dụng Ethidium bromide có hại cho cơ thể con người và các quy trình thử nghiệm phức tạp này tạo cơ hội cho ô nhiễm và dương tính giả.Tuy nhiên, FQ-PCR chỉ cần mở nắp 1 lần trong quá trình nạp mẫu, quá trình tiếp theo hoàn toàn là thao tác ống kín, không cần xử lý hậu PCR, tránh được nhiều nhược điểm trong thao tác PCR truyền thống.Thí nghiệm thường sử dụng máy luân nhiệt PCR ABI7100 do công ty PE phát triển.
Thiết bị này có các đặc điểm sau: ① Ứng dụng rộng rãi: Nó có thể được sử dụng để định lượng sản phẩm PCR DNA và RNA, nghiên cứu biểu hiện gen, phát hiện mầm bệnh và tối ưu hóa các điều kiện PCR.② Nguyên tắc định lượng độc đáo: Sử dụng các đầu dò được dán nhãn huỳnh quang, lượng huỳnh quang sẽ tích lũy trong chu kỳ PCR sau khi kích thích bằng laser, để đạt được mục đích định lượng.③ Hiệu suất làm việc cao: Máy luân nhiệt PCR 9600 tích hợp, điều khiển bằng máy tính trong 1 đến 2 giờ để hoàn thành việc khuếch đại và định lượng 96 mẫu một cách tự động và đồng bộ.④ Không cần điện di trên gel: Không cần pha loãng và điện di mẫu, chỉ cần sử dụng đầu dò đặc biệt để phát hiện trực tiếp trong ống phản ứng.⑤Không gây ô nhiễm trong đường ống: Ống phản ứng được bao kín hoàn toàn độc đáo và hệ thống dẫn quang điện được sử dụng, vì vậy không cần phải lo lắng về ô nhiễm.⑥Kết quả có thể lặp lại: phạm vi động định lượng lên tới năm bậc độ lớn.Vì vậy, kể từ khi công nghệ này được phát triển thành công, nó đã được nhiều nhà nghiên cứu khoa học đánh giá cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
2 Nguyên tắc và phương pháp
Nguyên lý hoạt động của FQ-PCR là sử dụng hoạt tính exonuclease 5′→3′ của enzyme Taq để thêm mẫu dò có đánh dấu huỳnh quang vào hệ thống phản ứng PCR.Mẫu dò có thể lai đặc hiệu với mẫu DNA có trong trình tự mồi.Đầu 5′ của đầu dò được dán nhãn bằng gen phát huỳnh quang FAM (6-carboxyfluorescein, cực đại phát huỳnh quang ở 518nm) và đầu 3′ được dán nhãn TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, cực đại phát huỳnh quang ở 582nm), đầu 3′ của đầu dò được phosphoryl hóa để ngăn không cho đầu dò được mở rộng trong quá trình khuếch đại PCR.Khi đầu dò vẫn còn nguyên vẹn, nhóm chất khử sẽ triệt tiêu sự phát huỳnh quang của nhóm phát ra.Sau khi nhóm phát quang được tách ra khỏi nhóm dập tắt, sự ức chế sẽ được dỡ bỏ và mật độ quang ở bước sóng 518nm tăng lên và được phát hiện bởi hệ thống phát hiện huỳnh quang. Trong giai đoạn tái tạo, đầu dò lai với DNA mẫu và enzyme Taq trong giai đoạn mở rộng di chuyển dọc theo mẫu DNA với phần mở rộng của đoạn mồi.Khi đầu dò bị cắt, hiệu ứng dập tắt được giải phóng và tín hiệu huỳnh quang được giải phóng.Mỗi khi mẫu được sao chép, một đầu dò sẽ bị cắt, kèm theo việc giải phóng tín hiệu huỳnh quang.Vì có mối quan hệ một đối một giữa số lượng fluorophores được giải phóng và số lượng sản phẩm PCR, kỹ thuật này có thể được sử dụng để định lượng chính xác mẫu.Dụng cụ thí nghiệm thường sử dụng máy luân nhiệt PCR ABI7100 do công ty PE phát triển và cũng có thể sử dụng các máy luân nhiệt khác.Nếu hệ thống phản ứng loại phản ứng ABI7700 được sử dụng cho thí nghiệm, sau khi phản ứng hoàn thành, kết quả định lượng có thể được đưa ra trực tiếp thông qua phân tích máy tính.Nếu sử dụng các máy chu trình nhiệt khác thì cần sử dụng detector huỳnh quang để đo đồng thời tín hiệu huỳnh quang trong ống phản ứng để tính RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ biểu thị tỷ lệ giữa cường độ phát quang của nhóm phát huỳnh quang trong ống mẫu với cường độ phát quang của nhóm dập tắt, RQ- biểu thị tỷ lệ của cả hai trong ống trắng, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) biểu thị lượng tín hiệu huỳnh quang thay đổi trong quá trình PCR Sau khi xử lý dữ liệu, có thể thu được kết quả định lượng.Do sự ra đời của các đầu dò huỳnh quang, độ đặc hiệu của thí nghiệm được cải thiện đáng kể.Thiết kế đầu dò nói chung phải đáp ứng các điều kiện sau: ①Chiều dài của đầu dò phải khoảng 20-40 đế để đảm bảo tính đặc hiệu của liên kết.②Hàm lượng GC base nằm trong khoảng từ 40% đến 60% để tránh trùng lặp trình tự nucleotide đơn.③ Tránh lai ghép hoặc trùng lặp mồi.④ Độ ổn định của liên kết giữa đầu dò và mẫu lớn hơn độ ổn định của liên kết giữa mồi và mẫu, vì vậy giá trị Tm của đầu dò phải cao hơn giá trị Tm của mồi ít nhất 5°C.Ngoài ra, nồng độ của mẫu dò, tính tương đồng giữa mẫu dò và trình tự mẫu và khoảng cách giữa mẫu dò và mồi đều có tác động đến kết quả thí nghiệm.
Những sảm phẩm tương tự:
Trung Quốc Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Nhà sản xuất và Nhà cung cấp |Foregene (foreivd.com)
Thời gian đăng: 15-Oct-2021
