Cơ sở thiết kế sơn lót (99% vấn đề có thể được giải quyết)
1. Độ dài mồi: SGK yêu cầu 15-30bp, thông thường khoảng 20bp.Điều kiện thực tế tốt hơn là 18-24bp để đảm bảo tính đặc hiệu, nhưng mồi càng dài càng tốt, primer quá dài cũng sẽ làm giảm tính đặc hiệu và giảm năng suất.
2. Khoảng khuếch đại mồi: 200-500bp là phù hợp và đoạn có thể được mở rộng thành 10kb trong các điều kiện cụ thể.
3. Cơ sở sơn lót: Hàm lượng G+C nên là 40-60%, quá ít G+C hiệu ứng khuếch đại không tốt, quá nhiều G+C dễ xuất hiện các dải không đặc hiệu.ATGC được phân phối ngẫu nhiên tốt nhất, tránh các cụm có hơn 5 nucleotide purine hoặc pyrimidine.Đa gc cho các trình tự trung gian và đầu 5′ để tăng tính ổn định, tránh GC giàu ở đầu 3′, không có GC cho 3 gốc cuối hoặc không có GC cho 3 trong số 5 gốc cuối.
4. Tránh cấu trúc thứ cấp trong mồi và tránh bổ sung giữa hai mồi, đặc biệt là bổ sung ở đầu 3 ', nếu không sẽ hình thành dimer mồi và tạo ra các dải khuếch đại không đặc hiệu.
5. Các base ở đầu 3' của mồi, đặc biệt là các base cuối cùng và áp chót, nên bắt cặp chặt chẽ để tránh PCR thất bại do các base đầu cuối không bắt cặp.
6. Các đoạn mồi có hoặc có thể được thêm vào các vị trí phân cắt thích hợp và trình tự mục tiêu được khuếch đại tốt nhất nên có các vị trí phân cắt thích hợp, điều này rất có lợi cho phân tích phân cắt hoặc nhân bản phân tử.
7. Tính đặc hiệu của đoạn mồi: đoạn mồi không được có sự tương đồng rõ ràng với các trình tự khác trong cơ sở dữ liệu trình tự axit nucleic.
8. Học sử dụng các phần mềm: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Phần thiết kế online này là tốt nhất).
Nội dung trên có thể giải quyết ít nhất 99% các vấn đề thiết kế mồi.
Kiểm soát các chi tiết của thiết kế sơn lót
1. Chiều dài sơn lót
Độ dài mồi chung là 18~30 base.Nói chung, yếu tố quan trọng nhất quyết định nhiệt độ ủ của mồi là chiều dài của mồi.Nhiệt độ ủ của sơn lót thường được chọn (giá trị Tm -5 ℃) và một số sử dụng trực tiếp giá trị Tm.Các công thức sau đây có thể được sử dụng để tính toán sơ bộ nhiệt độ ủ của mồi.
Khi độ dài của mồi nhỏ hơn 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Khi độ dài của mồi lớn hơn 20bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/length-5℃
Ngoài ra, nhiều phần mềm cũng có thể được sử dụng để tính toán nhiệt độ ủ, nguyên tắc tính toán sẽ khác nhau, vì vậy đôi khi giá trị tính toán có thể có một khoảng cách nhỏ.Để tối ưu hóa phản ứng PCR, chúng tôi sử dụng các đoạn mồi ngắn nhất đảm bảo nhiệt độ gắn không dưới 54℃ để đạt hiệu quả và độ đặc hiệu tốt nhất.
Nhìn chung, độ đặc hiệu của mồi tăng theo hệ số bốn đối với mỗi nucleotide bổ sung, do đó chiều dài mồi tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng là 18 nucleotide.Giới hạn trên của chiều dài mồi không quan trọng lắm, chủ yếu liên quan đến hiệu suất phản ứng.Do entropy, đoạn mồi càng dài thì tốc độ ủ để liên kết với DNA đích để tạo thành khuôn mẫu sợi kép ổn định cho DNA polymerase liên kết càng thấp.
Khi sử dụng phần mềm để thiết kế mồi, độ dài của mồi có thể được xác định lần lượt bằng giá trị TM, đặc biệt đối với mồi của PCR định lượng huỳnh quang, nên kiểm soát TM=60℃ hoặc hơn.
nội dung 2.GC
Nói chung, nội dung của G + C trong trình tự mồi là 40% ~ 60%, và hàm lượng GC và giá trị Tm của một cặp mồi phải được phối hợp.Nếu mồi có xu hướng GC hoặc AT nghiêm trọng, có thể thêm một lượng thích hợp đuôi A, T hoặc G và C vào đầu 5' của mồi.
3. Nhiệt độ ủ
Nhiệt độ ủ phải thấp hơn 5oC so với nhiệt độ không hoạt động.Nếu số lượng mồi nhỏ, nhiệt độ ủ có thể được tăng lên một cách thích hợp, điều này có thể làm tăng độ đặc hiệu của PCR.Nếu số lượng cơ sở lớn, nhiệt độ ủ có thể giảm một cách thích hợp.Chênh lệch nhiệt độ ủ giữa một cặp mồi là 4℃ ~ 6℃ sẽ không ảnh hưởng đến hiệu suất PCR, nhưng lý tưởng nhất là nhiệt độ ủ của một cặp mồi là như nhau, có thể dao động trong khoảng 55℃ ~ 75℃.
4. Tránh khu vực cấu trúc thứ cấp của mẫu khuếch đại
Tốt nhất là tránh vùng cấu trúc thứ cấp của mẫu khi chọn đoạn được khuếch đại.Cấu trúc thứ cấp ổn định của đoạn mục tiêu có thể được dự đoán và ước tính bằng phần mềm máy tính có liên quan, rất hữu ích cho việc lựa chọn mẫu.Kết quả thực nghiệm cho thấy sự giãn nở thường không thành công khi năng lượng tự do (△G) của vùng cần giãn nở nhỏ hơn 58,6lkJ/mol.
5. Không khớp với DNA mục tiêu
Khi trình tự DNA mục tiêu được khuếch đại lớn, một đoạn mồi có thể liên kết với nhiều phần của DNA mục tiêu, dẫn đến kết quả xuất hiện nhiều dải.Lúc này cần sử dụng phần mềm BLAST kiểm tra, website:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Chọn Căn chỉnh hai chuỗi (bl2seq).
Việc dán trình tự mồi vào vùng 1 và trình tự DNA đích vào vùng 2 có thể hoán đổi cho nhau và BLAST tính toán khả năng bổ sung, đối nghĩa và các khả năng khác, vì vậy người dùng không cần chú ý liệu cả hai chuỗi có phải là chuỗi cảm giác hay không.Bạn cũng có thể nhập số GI nếu bạn biết số GI của trình tự trong cơ sở dữ liệu, vì vậy bạn không phải dán một phần lớn của trình tự.Cuối cùng, nhấn Align at 3 để xem đoạn mồi có nhiều vị trí tương đồng trong DNA đích hay không.
6. Thiết bị đầu cuối mồi
Đầu 3' của đoạn mồi là nơi phần mở rộng bắt đầu, vì vậy điều quan trọng là phải ngăn chặn sự không phù hợp bắt đầu từ đó.Đầu 3' không được nhiều hơn 3 chữ G hoặc C liên tiếp, vì điều này sẽ khiến đoạn mồi bị kích hoạt nhầm trong vùng trình tự làm giàu G+C.Đầu 3′ không thể tạo thành bất kỳ cấu trúc thứ cấp nào, ngoại trừ trong các phản ứng PCR đặc biệt (AS-PCR), đầu 3′ của primer không thể bắt cặp.Ví dụ: nếu vùng mã hóa được khuếch đại, đầu 3 'của đoạn mồi không nên kết thúc ở vị trí thứ ba của codon, vì vị trí thứ ba của codon dễ bị thoái hóa, điều này sẽ ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và hiệu quả của quá trình khuếch đại.Khi sử dụng mồi sáp nhập, hãy tham khảo bảng sử dụng codon, chú ý đến ưu tiên sinh học, không sử dụng mồi sáp nhập ở đầu 3′ và sử dụng nồng độ mồi cao hơn (1uM-3uM).
7. Cấu trúc bậc 2 của mồi
Bản thân các đoạn mồi không được có trình tự bổ sung, nếu không, các đoạn mồi sẽ tự gấp lại thành cấu trúc kẹp tóc và cấu trúc thứ cấp này sẽ ảnh hưởng đến sự liên kết của đoạn mồi và mẫu do cản trở không gian.Nếu sử dụng phán đoán nhân tạo, thì bản thân các gốc bổ sung liên tục của các đoạn mồi không được lớn hơn 3bp.Không nên có sự bổ sung giữa hai mồi, đặc biệt nên tránh sự chồng lấp bổ sung của đầu 3' để ngăn chặn sự hình thành các dimer mồi.Nói chung, không nên có nhiều hơn 4 bazơ liên tiếp tương đồng hoặc bổ sung giữa một cặp mồi.
8. Thêm điểm đánh dấu hoặc loci
Đầu 5' ít ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của khuếch đại và do đó có thể được sửa đổi mà không ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của khuếch đại.Sự biến đổi đầu 5' của primer bao gồm: bổ sung vị trí cắt hạn chế của enzyme;Biotin được dán nhãn, huỳnh quang, digoxin, Eu3+, v.v. Giới thiệu trình tự DNA liên kết với protein;Giới thiệu các vị trí đột biến, chèn và thiếu trình tự đột biến và giới thiệu trình tự khởi động, v.v. Các bazơ bổ sung ít nhiều sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại và tăng cơ hội hình thành dimer mồi, nhưng phải thực hiện một số nhượng bộ cho bước tiếp theo.Các trình tự bổ sung không tồn tại trên trình tự đích, chẳng hạn như các vị trí hạn chế và trình tự khởi đầu, có thể được thêm vào đầu 5′ của đoạn mồi mà không ảnh hưởng đến tính đặc hiệu.Các trình tự này không được đưa vào tính toán các giá trị Tm của mồi, nhưng nên được kiểm tra về tính bổ sung và cấu trúc thứ cấp bên trong.
9. Dòng con
Hầu hết thời gian, PCR chỉ là nhân bản sơ bộ, sau đó chúng ta cần sao chép đoạn đích vào các vectơ khác nhau, vì vậy chúng ta cần thiết kế các cơ sở bổ sung cho hoạt động tiếp theo trong bước PCR.
Một số trình tự được thiết kế cho subcloning được tóm tắt dưới đây.
Trang web hạn chế endonuclease hạn chế đã được thêm vào
Thêm các vị trí giới hạn enzyme là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để tạo dòng sản phẩm PCR.Nói chung, vị trí phân cắt là sáu đế, ngoài 5 'đầu của vị trí phân cắt cần thêm 2 ~ 3 đế bảo vệ.Tuy nhiên, số lượng các cơ sở bảo vệ cần thiết cho các enzym khác nhau là khác nhau.Ví dụ: SalⅠ không yêu cầu đế bảo vệ, EcoRⅤ yêu cầu 1 đế bảo vệ, NotⅠ yêu cầu 2 đế bảo vệ và Hind Ⅲ yêu cầu 3 đế bảo vệ.
LIC thêm đuôi
Tên đầy đủ của LIC là nhân bản không phụ thuộc vào dây chằng, một phương pháp nhân bản được phát minh bởi Navogen dành riêng cho một phần vectơ pET của nó.Chất mang pET được điều chế bằng phương pháp LIC có 12-15 đầu dính sợi đơn gốc không bổ sung, bổ sung cho các đầu dính tương ứng trên mảnh chèn đích.Đối với mục đích khuếch đại, trình tự mồi 5′ của đoạn được chèn phải bổ sung cho vectơ LIC.Hoạt động ngoại lai 3′→5′ của T4 DNA polymerase có thể tạo thành một đầu dính sợi đơn trên đoạn được chèn sau một thời gian ngắn.Bởi vì sản phẩm chỉ có thể được hình thành từ quá trình ủ lẫn nhau của mảnh chèn đã chuẩn bị và vectơ, nên phương pháp này rất nhanh và hiệu quả, đồng thời nó được nhân bản trực tiếp.
Đạo nhái TA thêm đuôi
Nhân bản TA không thể nhắm mục tiêu đoạn vào một vectơ, vì vậy sau đó Invitrogen đã giới thiệu một vectơ có thể nhắm mục tiêu sao chép, chứa bốn GTGGS cơ sở nổi bật ở một đầu.Vì vậy, trong thiết kế mồi PCR, nên bổ sung các trình tự bổ sung cho phù hợp để các đoạn có thể được “định hướng”.
Nếu bạn không có nhiều thời gian, bạn có thể thử tổng hợp trực tiếp, kết hợp gen với vectơ, đó là cái mà chúng tôi gọi là tổng hợp gen ET ở những người theo chủ nghĩa cơ bắp.
D. Phương pháp nhân bản In-Fusion
Không cần ligase, không cần phản ứng dài.Miễn là một trình tự ở cả hai đầu của vectơ tuyến tính hóa được đưa vào Trong thiết kế mồi, sau đó sản phẩm PCR và vectơ tuyến tính hóa được thêm vào dung dịch enzyme đã pha có chứa BSA và đặt ở nhiệt độ phòng trong nửa giờ, quá trình biến đổi có thể được thực hiện.Phương pháp này đặc biệt thích hợp cho việc chuyển đổi khối lượng lớn.
10. Hợp nhất sơn lót
Đôi khi, chỉ có thông tin trình tự hạn chế được biết về thiết kế mồi.Ví dụ, nếu chỉ biết trình tự axit amin, đoạn mồi hợp nhất có thể được thiết kế.Mồi hợp nhất là một hỗn hợp các trình tự khác nhau đại diện cho tất cả các khả năng bazơ khác nhau mã hóa một axit amin đơn lẻ.Để tăng tính đặc hiệu, bạn có thể tham khảo bảng sử dụng codon để giảm sự sát nhập theo sở thích sử dụng cơ sở của các sinh vật khác nhau.Hypoxanthine có thể bắt cặp với tất cả các bazơ để giảm nhiệt độ ủ của mồi.Không sử dụng các bazơ được thêm vào ở đầu 3′ của mồi vì việc ủ 3 bazơ cuối cùng ở đầu 3′ là đủ để bắt đầu PCR tại vị trí sai.Nồng độ mồi cao hơn (1μM đến 3μM) được sử dụng vì mồi trong nhiều hỗn hợp sáp nhập không đặc trưng cho mẫu đích.
Nguyên liệu PCRđiều khiển
1. Lượng sơn lót
Nồng độ của mỗi mồi là 0,1~1umol hoặc 10~100pmol.Tốt hơn là tạo ra kết quả cần thiết với lượng sơn lót thấp nhất.Nồng độ cao của mồi sẽ gây ra sự khuếch đại không phù hợp và không đặc hiệu, đồng thời làm tăng khả năng hình thành các chất làm mờ giữa các mồi.
2. Nồng độ sơn lót
Nồng độ mồi ảnh hưởng đến tính đặc hiệu.Nồng độ mồi tối ưu thường nằm trong khoảng từ 0,1 đến 0,5μM.Nồng độ mồi cao hơn dẫn đến sự khuếch đại của các sản phẩm không đặc hiệu.
3. Nhiệt độ ủ của sơn lót
Một thông số quan trọng khác đối với mồi là nhiệt độ nóng chảy (Tm).Đây là nhiệt độ khi 50% đoạn mồi và trình tự bổ sung được biểu diễn dưới dạng phân tử DNA sợi kép.Cần có Tm để đặt nhiệt độ ủ PCR.Lý tưởng nhất là nhiệt độ ủ đủ thấp để đảm bảo quá trình ủ hiệu quả của mồi với trình tự đích, nhưng đủ cao để giảm sự gắn kết không đặc hiệu.Nhiệt độ ủ hợp lý từ 55℃ đến 70℃.Nhiệt độ ủ thường được đặt thấp hơn 5oC so với Tm của lớp sơn lót.
Có một số công thức để thiết lập Tm, chúng khác nhau rất nhiều tùy thuộc vào công thức được sử dụng và trình tự mồi.Bởi vì hầu hết các công thức cung cấp giá trị Tm ước tính, tất cả các nhiệt độ ủ chỉ là điểm khởi đầu.Tính đặc hiệu có thể được cải thiện bằng cách phân tích một số phản ứng làm tăng dần nhiệt độ ủ.Bắt đầu dưới mức Tm-5℃ ước tính và tăng dần nhiệt độ ủ với mức tăng 2℃.Nhiệt độ ủ cao hơn sẽ làm giảm sự hình thành các dimer mồi và các sản phẩm không đặc hiệu.Để có kết quả tốt nhất, hai mồi nên có giá trị Tm gần đúng.Nếu chênh lệch Tm của các cặp mồi lớn hơn 5℃, các mồi sẽ cho thấy sự bắt đầu sai đáng kể bằng cách sử dụng nhiệt độ ủ thấp hơn trong chu kỳ.Nếu hai mồi Tm khác nhau, hãy đặt nhiệt độ ủ thành thấp hơn 5oC so với Tm thấp nhất.Ngoài ra, để tăng tính đặc hiệu, năm chu kỳ có thể được thực hiện đầu tiên ở nhiệt độ ủ được thiết kế cho Tm cao hơn, tiếp theo là các chu kỳ còn lại ở nhiệt độ ủ được thiết kế cho Tm thấp hơn.Điều này cho phép thu được một phần bản sao của mẫu đích trong các điều kiện chặt chẽ.
4. Độ tinh khiết và độ ổn định của lớp sơn lót
Độ tinh khiết tiêu chuẩn của mồi tùy chỉnh là đủ cho hầu hết các ứng dụng PCR.Việc loại bỏ các nhóm benzoyl và isobutylyl bằng cách khử muối là tối thiểu và do đó không can thiệp vào PCR.Một số ứng dụng yêu cầu tinh chế để loại bỏ bất kỳ trình tự không có độ dài đầy đủ nào trong quá trình tổng hợp.Những trình tự bị cắt ngắn này xảy ra do hiệu quả của quá trình tổng hợp DNA không phải là 100%.Đây là một quy trình tuần hoàn sử dụng các phản ứng hóa học lặp đi lặp lại khi mỗi bazơ được thêm vào để tạo ra DNA từ 3′ đến 5′.Bạn có thể thất bại trong cả hai chu kỳ.Các mồi dài hơn, đặc biệt là những mồi lớn hơn 50 base, có một tỷ lệ lớn các trình tự bị cắt ngắn và có thể yêu cầu tinh chế.
Hiệu suất mồi bị ảnh hưởng bởi hiệu quả của quá trình hóa học tổng hợp và phương pháp tinh chế.Các công ty dược phẩm sinh học, chẳng hạn như Cytology và Shengong, đều sử dụng đơn vị OD tối thiểu để đảm bảo tổng sản lượng của oligonucleoside.Sơn lót tùy chỉnh được vận chuyển ở dạng bột khô.Tốt nhất là hòa tan lại mồi trong TE sao cho nồng độ cuối cùng là 100μM.TE tốt hơn nước khử ion vì độ pH của nước thường có tính axit và sẽ gây ra sự thủy phân của oligonucleoside.
Độ ổn định của mồi phụ thuộc vào điều kiện bảo quản.Bột khô và sơn lót đã hòa tan nên được bảo quản ở -20℃.Chất mồi hòa tan trong TE ở nồng độ lớn hơn 10μM có thể bảo quản ổn định ở -20℃ trong 6 tháng, nhưng chỉ có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng (15℃ đến 30℃) trong vòng chưa đầy 1 tuần.Sơn lót dạng bột khô có thể được bảo quản ở -20 C trong ít nhất 1 năm và ở nhiệt độ phòng (15 C đến 30 C) trong tối đa 2 tháng.
5. Enzyme và nồng độ của chúng
Hiện tại, Taq DNA polymerase được sử dụng về cơ bản là enzyme kỹ thuật gen được tổng hợp bởi vi khuẩn coliform.Lượng enzyme cần thiết để xúc tác cho một phản ứng PCR điển hình là khoảng 2,5U (liên quan đến tổng thể tích phản ứng là 100ul).Nếu nồng độ quá cao có thể dẫn đến hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu;nếu nồng độ quá thấp thì lượng sản phẩm tổng hợp sẽ giảm.
6. Chất lượng và nồng độ dNTP
Chất lượng của dNTP có liên quan chặt chẽ đến nồng độ và hiệu quả của quá trình khuếch đại PCR.Bột dNTP có dạng hạt và tính biến đổi của nó sẽ mất hoạt tính sinh học nếu được bảo quản không đúng cách.Dung dịch dNTP có tính axit nên dùng ở nồng độ cao, dùng dung dịch đệm NaOH 1M hoặc Tris.HCL 1M để điều chỉnh PH về 7.0 ~ 7.5, đóng gói số lượng ít, bảo quản đông lạnh -20℃.Nhiều lần đóng băng-tan băng sẽ làm suy giảm dNTP.Trong phản ứng PCR, dNTP phải là 50 ~ 200umol/L.Đặc biệt cần chú ý nồng độ của 4 DNTPS phải bằng nhau (chuẩn bị số mol bằng nhau).Nếu nồng độ của bất kỳ một trong số chúng khác với những cái khác (cao hơn hoặc thấp hơn), sẽ gây ra sự không phù hợp.Nồng độ quá thấp sẽ làm giảm sản phẩm PCR.dNTP có thể kết hợp với Mg2+ và làm giảm nồng độ của Mg2+ tự do.
7. Mẫu (gen đích) axit nucleic
Số lượng và mức độ tinh sạch của axit nucleic mẫu là một trong những mắt xích quan trọng quyết định sự thành công hay thất bại của PCR.Các phương pháp tinh chế DNA truyền thống thường sử dụng SDS và protease K để tiêu hóa và xử lý mẫu vật.Các chức năng chính của SDS là: hòa tan lipid và protein trên màng tế bào, do đó phá hủy màng tế bào bằng cách hòa tan protein màng và phân tách protein nhân trong tế bào, SDS cũng có thể kết hợp với protein và kết tủa;Protease K có thể thủy phân và tiêu hóa protein, đặc biệt là histone liên kết với DNA, sau đó sử dụng dung môi hữu cơ phenol và chloroform để chiết xuất protein và các thành phần tế bào khác, đồng thời sử dụng ethanol hoặc rượu isopropyl để kết tủa axit nucleic.Axit nucleic được chiết xuất có thể được sử dụng làm khuôn mẫu cho các phản ứng PCR.Đối với các mẫu xét nghiệm lâm sàng nói chung, có thể sử dụng phương pháp nhanh chóng và đơn giản để giải thể tế bào, ly giải mầm bệnh, tiêu hóa và loại bỏ protein khỏi nhiễm sắc thể thành gen mục tiêu tự do và được sử dụng trực tiếp để khuếch đại PCR.Chiết xuất mẫu RNA thường sử dụng phương pháp guanidine isothiocyanate hoặc protease K để ngăn RNase phân hủy RNA.
nồng độ 8.Mg2+
Mg2+ có ảnh hưởng đáng kể đến tính đặc hiệu và năng suất khuếch đại PCR.Trong phản ứng PCR nói chung, khi nồng độ của các dNTP khác nhau là 200umol/L, nồng độ thích hợp của Mg2+ là 1,5 ~ 2,0mmol/L.Nồng độ Mg2+ quá cao thì tính đặc hiệu phản ứng giảm, xảy ra hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu, nồng độ quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính Taq DNA polymerase dẫn đến giảm sản phẩm phản ứng.
Các ion magiê ảnh hưởng đến một số khía cạnh của PCR, chẳng hạn như hoạt động DNA polymerase, ảnh hưởng đến năng suất;Một ví dụ khác là ủ mồi, ảnh hưởng đến tính đặc hiệu.dNTP và khuôn mẫu liên kết với ion magie, làm giảm lượng ion magie tự do cần thiết cho hoạt động của enzym.Nồng độ ion magie tối ưu khác nhau đối với các cặp mồi và khuôn mẫu khác nhau, nhưng nồng độ bắt đầu PCR thông thường với 200μM dNTP là 1,5mM (lưu ý: Đối với PCR định lượng thời gian thực, hãy sử dụng dung dịch ion magie 3 đến 5mM với đầu dò huỳnh quang).Nồng độ cao hơn của các ion magiê tự do làm tăng năng suất, nhưng cũng làm tăng độ khuếch đại không đặc hiệu và giảm độ trung thực.Để xác định nồng độ tối ưu, phép chuẩn độ ion magie được thực hiện theo từng bước 0,5mM từ 1mM đến 3mM.Để giảm sự phụ thuộc vào việc tối ưu hóa ion magie, có thể sử dụng Platinum Taq DNA polymerase.Platinum Taq DNA polymerase có thể duy trì chức năng trong phạm vi nồng độ ion magiê rộng hơn so với Taq DNA polymerase và do đó ít yêu cầu tối ưu hóa hơn.
9. Phụ gia thúc đẩy Pcr
Tối ưu hóa nhiệt độ ủ, thiết kế mồi và nồng độ ion magiê là đủ để khuếch đại đặc hiệu cao của hầu hết các mẫu;tuy nhiên, một số mẫu, bao gồm những mẫu có hàm lượng GC cao, yêu cầu các biện pháp bổ sung.Các chất phụ gia ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA cung cấp một cách khác để cải thiện tính đặc hiệu và năng suất của sản phẩm.Biến tính hoàn toàn của mẫu là cần thiết để có kết quả tốt nhất.
Ngoài ra, cấu trúc thứ cấp ngăn chặn sự liên kết mồi và mở rộng enzyme.
Các chất phụ gia PCR, bao gồm formamide, DMSO, glycerin, betaine và PCRx Enhancer Solution, giúp tăng cường khả năng khuếch đại.Cơ chế khả thi của chúng là giảm nhiệt độ nóng chảy, do đó hỗ trợ quá trình ủ mồi và hỗ trợ mở rộng DNA polymerase qua vùng cấu trúc thứ cấp.Giải pháp PCRx có những ưu điểm khác.Cần tối ưu hóa tối thiểu ion magie khi sử dụng với Platinum Taq DNA polymerase và Platinum Pfx DNA polymerase.Như vậy, kỹ thuật Platinum được kết hợp với chất phụ gia để tăng tính đặc hiệu đồng thời giảm sự phụ thuộc của phương pháp thứ ba, tối ưu hóa ion magie.Để có kết quả tốt nhất, nồng độ của các chất phụ gia nên được tối ưu hóa, đặc biệt là DMSO, formamide và glycerol, những chất ức chế Taq DNA polymerase.
10. Khởi đầu nóng bỏng
Hot start PCR là một trong những phương pháp quan trọng nhất để cải thiện tính đặc hiệu của PCR bên cạnh việc thiết kế mồi tốt.Mặc dù nhiệt độ kéo dài tối ưu của Taq DNA polymerase là 72℃, polymerase vẫn hoạt động ở nhiệt độ phòng.Do đó, các sản phẩm không đặc hiệu được tạo ra khi nhiệt độ giữ thấp hơn nhiệt độ ủ trong quá trình chuẩn bị phản ứng PCR và khi bắt đầu chu kỳ nhiệt.Sau khi hình thành, các sản phẩm không đặc hiệu này được khuếch đại một cách hiệu quả.PCR khởi động nóng đặc biệt hiệu quả khi các vị trí được sử dụng để thiết kế mồi bị giới hạn bởi vị trí của các yếu tố di truyền, chẳng hạn như đột biến định hướng tại chỗ, nhân bản biểu hiện hoặc xây dựng và thao tác các yếu tố di truyền được sử dụng cho kỹ thuật DNA.
Một phương pháp phổ biến để hạn chế hoạt động của Taq DNA polymerase là chuẩn bị dung dịch phản ứng PCR trên đá và đặt nó vào thiết bị PCR đã được làm nóng trước.Phương pháp này đơn giản và rẻ tiền, nhưng nó không hoàn thành hoạt động của enzyme và do đó không loại bỏ hoàn toàn sự khuếch đại của các sản phẩm không đặc hiệu.
Mồi nhiệt làm chậm quá trình tổng hợp DNA bằng cách ức chế một thành phần thiết yếu cho đến khi thiết bị PCR đạt đến nhiệt độ biến tính.Hầu hết các phương pháp khởi tạo nhiệt thủ công, bao gồm cả việc bổ sung Taq DNA polymerase bị trì hoãn, đều cồng kềnh, đặc biệt đối với các ứng dụng thông lượng cao.Các phương pháp mồi nhiệt khác sử dụng một tấm chắn sáp để bao bọc một thành phần thiết yếu, bao gồm các ion magie hoặc enzym, hoặc để cách ly vật lý các thành phần phản ứng, chẳng hạn như mẫu và chất đệm.Trong chu kỳ nhiệt, các thành phần khác nhau được giải phóng và trộn lẫn với nhau khi sáp tan chảy.Giống như phương pháp khởi động nóng thủ công, phương pháp tấm chắn sáp cồng kềnh và dễ bị nhiễm bẩn và không phù hợp với các ứng dụng có thông lượng cao.
Platinum DNA polymerase thuận tiện và hiệu quả cho PCR khởi động nóng tự động.Platinum Taq DNA polymerase bao gồm Taq DNA polymerase tái tổ hợp kết hợp với kháng thể đơn dòng chống lại Taq DNA polymerase.Các kháng thể được tạo ra bằng PCR để ức chế hoạt động của enzyme trong quá trình giữ nhiệt độ kéo dài.Taq DNA polymerase được giải phóng vào phản ứng trong quá trình cách nhiệt 94℃ của bước biến tính, khôi phục hoạt tính polymerase đầy đủ.Trái ngược với Taq DNA polymerase đã biến đổi về mặt hóa học để khởi tạo nhiệt, enzyme Platinum không yêu cầu cách nhiệt kéo dài ở 94℃ (10 đến 15 phút) để kích hoạt polymerase.Với PlatinumTaq DNA polymerase, 90% hoạt tính của Taq DNA polymerase được khôi phục sau 2 phút ở 94℃.
11. Nest-PCR
Các vòng khuếch đại liên tiếp sử dụng mồi lồng nhau có thể cải thiện độ đặc hiệu và độ nhạy.Vòng đầu tiên là khuếch đại tiêu chuẩn từ 15 đến 20 chu kỳ.Một phần nhỏ của sản phẩm khuếch đại ban đầu được pha loãng từ 100 đến 1000 lần và được thêm vào vòng khuếch đại thứ hai trong 15 đến 20 chu kỳ.Ngoài ra, sản phẩm khuếch đại ban đầu có thể được định cỡ bằng tinh chế gel.Đoạn mồi lồng nhau được sử dụng trong vòng khuếch đại thứ hai, đoạn mồi này có thể liên kết với trình tự đích bên trong đoạn mồi đầu tiên.Việc sử dụng PCR lồng nhau làm giảm khả năng khuếch đại của nhiều vị trí đích vì có ít trình tự đích bổ sung cho cả hai bộ mồi.Tổng số chu kỳ giống nhau (30 đến 40) với cùng đoạn mồi đã khuếch đại các vị trí không đặc hiệu.Nested PCR làm tăng độ nhạy của các trình tự mục tiêu hạn chế (ví dụ: mrnas hiếm) và cải thiện tính đặc hiệu của PCRS khó (ví dụ: 5′ RACE).
12. PCR giảm dần
PCR giảm dần cải thiện tính đặc hiệu bằng cách sử dụng các điều kiện ủ chặt chẽ trong vài chu kỳ PCR đầu tiên.Chu kỳ bắt đầu ở nhiệt độ ủ cao hơn khoảng 5℃ so với Tm ước tính, sau đó mỗi chu kỳ được giảm từ 1℃ đến 2℃ cho đến khi nhiệt độ ủ thấp hơn Tm 5℃.Chỉ mẫu đích có độ tương đồng cao nhất mới được khuếch đại.Các sản phẩm này tiếp tục mở rộng trong các chu kỳ tiếp theo, lấn át các sản phẩm không đặc hiệu được khuếch đại.PCR giảm dần rất hữu ích cho các phương pháp không biết mức độ tương đồng giữa mồi và mẫu đích, chẳng hạn như dấu vân tay DNA AFLP.
Bộ dụng cụ PCR liên quan
Người hùng PCR 2×TMHệ thống Mix có khả năng chống lại các chất ức chế PCR cao hơn so với hệ thống PCR Mix thông thường và có thể dễ dàng đối phó với quá trình khuếch đại PCR của các mẫu phức tạp khác nhau.Hệ thống phản ứng độc đáo và Taq Hero hiệu quả cao làm cho phản ứng PCR có hiệu suất khuếch đại, độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn.
Hiệu suất khuếch đại cao hơn
Nó có hoạt tính 5'→3' DNA polymerase và hoạt tính exonuclease 5'→3', không có hoạt tính exonuclease 3'→5'.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Bộ đệm cụ thể—được tối ưu hóa và enzyme Taq khởi động nóng có thể ngăn chặn sự khuếch đại không đặc hiệu và sự hình thành dimer mồi
Độ nhạy cao—có thể phát hiện các bản sao thấp của mẫu
Bộ kit sử dụng thuốc thử phiên mã ngược Foregene độc đáo và Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kết hợp với hệ thống phản ứng độc đáo để cải thiện hiệu quả hiệu quả khuếch đại và tính đặc hiệu của phản ứng.
Thời gian đăng: May-09-2023
