Độ đặc hiệu của phát hiện

Trong hầu hết các trường hợp, mục đích của việc thiết kế mồi là tối đa hóa tính đặc hiệu của PCR.Điều này được xác định bởi ảnh hưởng ít nhiều có thể dự đoán được của nhiều biến số.Một biến số quan trọng là trình tự ở đầu 3′ của đoạn mồi.

Điều quan trọng là, các xét nghiệm PCR được thiết kế cho tính đặc hiệu có nhiều khả năng duy trì hiệu quả cao trên dải động rộng, bởi vì xét nghiệm không tạo ra các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu, do đó cạnh tranh với thuốc thử PCR hoặc ức chế phản ứng khuếch đại chính.

Tất nhiên, trong một số trường hợp, tính đặc hiệu không phải là quan trọng nhất, chẳng hạn như khi mục tiêu là định lượng các mầm bệnh có liên quan chặt chẽ nhưng khác nhau, thì cần phải có các tiêu chuẩn thiết kế, tối ưu hóa và xác minh đặc biệt.

Đường cong nóng chảy là một phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá tính đặc hiệu của các bộ khuếch đại, ít nhất là về việc có nên khuếch đại một mục tiêu hay không.Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng các đường cong nóng chảy có thể gây hiểu lầm bởi vì, ví dụ, chúng có thể bị ảnh hưởng bởi tác động kết hợp của mồi dưới mức tối ưu và nồng độ khuôn mẫu thấp.

P5 |Đường cong nóng chảy cho thấy sự dịch chuyển Tm thu được từ hai lần phát hiện các lượng khác nhau của hai DNA mục tiêu.

A. Ở nồng độ cao hơn (quảng cáo)), không có dime mồi rõ ràng sau khi phép đo qPCR hoàn tất.Khi nồng độ mẫu giảm xuống còn 50 bản sao (e), một sản phẩm không đặc hiệu bắt đầu xuất hiện và trở thành sản phẩm duy nhất ở nồng độ thấp nhất (f).

B. Thử nghiệm ghi lại cùng một Tms ở tất cả các nồng độ mục tiêu và không có chất làm mờ mồi rõ ràng ngay cả ở nồng độ thấp nhất (5 bản sao).Khi sử dụng hai phương pháp phát hiện này, không có sản phẩm khuếch đại nào được phát hiện trong NTC.

P5 hiển thị các đường cong hòa tan thu được với các mẫu trong đó mẫu có mặt ở các nồng độ khác nhau.P 5a cho thấy rằng ở hai nồng độ thấp nhất, Tms của các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu được tạo ra thấp hơn Tms của các bộ khuếch đại cụ thể.

Rõ ràng, phương pháp phát hiện này không thể được sử dụng một cách đáng tin cậy để phát hiện các mục tiêu tồn tại ở nồng độ thấp.

Thật thú vị, NTC, tức là các mẫu hoàn toàn không có DNA, không ghi lại các sản phẩm khuếch đại (không đặc hiệu), cho thấy DNA bộ gen nền có thể tham gia vào quá trình khuếch đại/ trùng hợp không đặc hiệu.

Đôi khi không thể khắc phục các đoạn mồi nền và khuếch đại không đặc hiệu như vậy, nhưng thường có thể thiết kế một phương pháp phát hiện không có khuếch đại không đặc hiệu ở bất kỳ nồng độ mẫu và NTC nào (P 5b).

Ở đây, thậm chí ghi lại sự khuếch đại của nồng độ mục tiêu với Cq là 35 sẽ tạo ra một đường cong hòa tan cụ thể.Tương tự, NTC không có dấu hiệu khuếch đại không đặc hiệu.Đôi khi, hoạt động phát hiện có thể phụ thuộc vào dung dịch mẹ và chỉ phát hiện được sự khuếch đại không đặc hiệu trong các chế phẩm đệm nhất định, có thể liên quan đến các nồng độ Mg2+ khác nhau.

Tính ổn định của phát hiện

Việc tối ưu hóa Ta là một bước hữu ích trong quy trình xác minh và tối ưu hóa theo kinh nghiệm để phát hiện qPCR.Nó cung cấp một dấu hiệu trực tiếp về độ bền của bộ mồi bằng cách hiển thị nhiệt độ (hoặc phạm vi nhiệt độ) tạo ra Cq thấp nhất mà không cần khuếch đại NTC.

Sự khác biệt gấp hai đến bốn lần về độ nhạy có thể không quan trọng đối với những người có biểu hiện mRNA cao, nhưng đối với các xét nghiệm chẩn đoán, nó có thể có nghĩa là sự khác biệt giữa kết quả dương tính và âm tính giả.

Thuộc tính Ta của đoạn mồi qPCR có thể khác nhau rất nhiều.Một số thử nghiệm không mạnh lắm và nếu chúng không được thực hiện dưới giá trị Ta tối ưu của mồi, chúng sẽ nhanh chóng sụp đổ.

Điều này rất quan trọng vì loại phát hiện này thường có vấn đề trong thế giới thực và độ tinh khiết của mẫu, nồng độ DNA hoặc sự hiện diện của DNA khác có thể không tối ưu.

Ngoài ra, số lượng bản sao mục tiêu có thể thay đổi trong phạm vi rộng và thuốc thử, đồ dùng bằng nhựa hoặc dụng cụ có thể khác với những thứ được sử dụng khi thiết lập thử nghiệm.

P6|Gradient nhiệt độ cho thấy mức độ mạnh mẽ khác nhau của phát hiện PCR.

A. Sử dụng hỗn hợp chính Sensifast SYBR của Bioline (số danh mục BIO-98050) để thực hiện PCR trên cDNA được điều chế từ RNA não người.

B. Sử dụng công cụ CFX qPCR của Bio-Rad để ghi lại bản đồ khuếch đại và đường cong hòa tan của apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGGTGATCTCCTAGG).

C. Đồ thị khuếch đại và đường cong nóng chảy của ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. Đồ thị khuếch đại và đường cong hòa tan của GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cq được ghi lại ở các nhiệt độ ủ khác nhau, cho thấy sự khác biệt về Cq được ghi dưới gradient nhiệt độ 7C.

P 6 cho thấy kết quả điển hình của xét nghiệm không mong muốn, trong đó qPCR được thực hiện bằng cách sử dụng Tas gradient trong khoảng từ 59C đến 67C (P 6a), sử dụng đoạn mồi cho ba gen đặc hiệu của não người.

Có thể thấy từ biểu đồ khuếch đại rằng các đoạn mồi Opalin không lý tưởng lắm vì phạm vi Ta tối ưu của chúng rất hẹp (Hình 6b), nghĩa là, các Cq được phân tán rộng rãi, dẫn đến các Cq bị chênh lệch đáng kể so với Cq Thấp tối ưu của chúng.

Phương pháp phát hiện này không ổn định và có thể dẫn đến khuếch đại dưới mức tối ưu.Do đó, cặp mồi này nên được thiết kế lại.Ngoài ra, phân tích đường cong nóng chảy (hình nhỏ) cho thấy tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện này cũng có thể có vấn đề, vì đường cong nóng chảy của mỗi Ta là khác nhau.

Phương pháp phát hiện ACSBG1 được trình bày trong P 6c mạnh mẽ hơn phương pháp phát hiện Opalin ở trên, nhưng nó vẫn còn xa lý tưởng và có khả năng là nó có thể được cải thiện.

Tuy nhiên, chúng tôi nhấn mạnh rằng không có mối liên hệ cần thiết nào giữa độ mạnh và độ đặc hiệu, bởi vì đường cong hòa tan được tạo ra bởi phương pháp phát hiện này cho thấy cùng một giá trị đỉnh trong tất cả các Tas (hình nhỏ).

Mặt khác, thử nghiệm độ mạnh có tính khoan dung cao hơn nhiều, tạo ra các Cq tương tự trong nhiều loại TAS, như trong thử nghiệm GFAP được trình bày trong P 6d.

Sự khác biệt về Cq thu được trong cùng phạm vi 8 độ C nhỏ hơn 1 và đường cong hòa tan (hình nhỏ) xác nhận các đặc điểm phát hiện trong phạm vi nhiệt độ này.Điều đáng chú ý là phạm vi Ta được tính toán và phạm vi Ta thực tế có thể rất khác nhau.

Có nhiều hướng dẫn được thiết kế để giúp các nhà nghiên cứu thiết kế các đoạn mồi hiệu quả, hầu hết các hướng dẫn này đều dựa trên các quy tắc đã có từ lâu và người ta chú ý nhiều đến đầu 3′ của đoạn mồi.Chúng tôi thường khuyến nghị thêm một G hoặc C ở đầu 3' và hai đế G hoặc C (kẹp GC), nhưng không nhiều hơn hai trong số 5 đế cuối cùng.

Trên thực tế, những quy tắc này có thể hướng dẫn các nhà nghiên cứu, nhưng chúng không nhất thiết phải đúng trong mọi trường hợp.

P7 |Đầu 3′ của mồi ít ảnh hưởng đến tính đặc hiệu hoặc hiệu quả.

A. Vị trí đoạn mồi của gen HIF-1α (NM_181054.2) ở người.

B. Sử dụng dung dịch gốc Agilent Brilliant III SYBR Green (Cat. No. 600882) để khuếch đại sáu mục thử nghiệm.

C. Đồ thị khuếch đại và đường cong nóng chảy được ghi lại bởi công cụ CFX qPCR của Bio-Rad và các đoạn mồi 3′end.NTC được hiển thị bằng màu đỏ.

D. Bản ghi Cqs của từng hạng mục xét nghiệm

Ví dụ: kết quả trong P 7 mâu thuẫn với quy tắc 3′end.Tất cả các thiết kế về cơ bản tạo ra các kết quả giống nhau, chỉ có hai tổ hợp mồi dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu trong NTC.

Tuy nhiên, chúng tôi không thể hỗ trợ hiệu ứng của clip GC, vì trong trường hợp này, sử dụng A hoặc T làm tối đa 30 cơ sở không làm giảm độ đặc hiệu.

Thử nghiệm C, trong đó đoạn mồi F kết thúc bằng GGCC, đã ghi lại các Cq trong NTC, cho thấy rằng người ta có thể muốn tránh các trình tự này ở cuối 30.Chúng tôi nhấn mạnh rằng cách duy nhất để xác định trình tự 3′end tốt nhất của một cặp mồi là đánh giá một số mồi ứng cử viên bằng thực nghiệm.

hiệu quả khuếch đại

Điều quan trọng là, mặc dù phát hiện PCR không đặc hiệu không bao giờ có thể trở nên cụ thể, nhưng hiệu quả khuếch đại có thể được điều chỉnh và tối đa hóa theo nhiều cách khác nhau bằng cách thay đổi enzyme, dung dịch mẹ, chất phụ gia và điều kiện chu trình.

Để đánh giá hiệu quả phát hiện PCR, tốt nhất là sử dụng độ pha loãng nối tiếp gấp 10 hoặc 5 lần axit nucleic mục tiêu, tức là “phương pháp đường cong chuẩn”.

Nếu các bộ khuếch đại PCR hoặc đích DNA tổng hợp được sử dụng để tạo đường cong chuẩn, thì các pha loãng nối tiếp của các đích này phải được trộn với một lượng DNA nền không đổi (chẳng hạn như DNA bộ gen).

P8 |Đường cong pha loãng để đánh giá hiệu quả PCR.

A. Sử dụng mồi cho HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA và R: TTGTCCTGTGGTGACTTTTCC và Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (số danh mục 600882) cho PCR và điều kiện đường cong nóng chảy.

B. 100 ng RNA được phiên mã ngược, pha loãng 2 lần và các mẫu cDNA pha loãng huyết thanh được pha loãng 5 lần thành 1 ng DNA bộ gen người.Đường cong nóng chảy được hiển thị trong hình nhỏ.

C. Phản ứng RT, pha loãng và pha loãng nối tiếp được lặp lại cho mẫu cDNA thứ hai và kết quả cũng tương tự.

P 8 cho thấy hai đường cong chuẩn, sử dụng cùng một phương pháp phát hiện trên hai mẫu cDNA khác nhau, kết quả là hiệu quả như nhau, khoảng 100% và giá trị R2 cũng tương tự, tức là mức độ phù hợp giữa dữ liệu thực nghiệm và đường hồi quy hoặc dữ liệu Mức độ tuyến tính.

Hai đường cong tiêu chuẩn có thể so sánh được, nhưng không hoàn toàn giống nhau.Nếu mục đích là định lượng chính xác mục tiêu, thì phải lưu ý rằng việc cung cấp phép tính số bản sao mà không giải thích độ không đảm bảo là không thể chấp nhận được

P9 |Độ không đảm bảo đo liên quan đến định lượng bằng đường chuẩn.

A. Sử dụng đoạn mồi GAPDH (NM_002046) để thực hiện phản ứng PCR và điều kiện đường cong nóng chảy.F: ACAGTTGCCATGTAGACC và R: TAACTGGTTGAGCACAGG và Bioline's Sensifast SYBR mastermix (số danh mục BIO-98050).

B. Biểu đồ khuếch đại, đường cong nóng chảy và đường chuẩn được ghi lại bằng thiết bị CFX qPCR của Bio-Rad.

C. Đồ thị đường chuẩn và khoảng tin cậy (CI) 95%.

D. Số bản sao và khoảng tin cậy 95% của ba giá trị Cq thu được từ đường cong pha loãng.

P 9 cho thấy rằng đối với thử nghiệm được tối ưu hóa, độ biến thiên vốn có của một đường cong chuẩn duy nhất xấp xỉ 2 lần (khoảng tin cậy 95%, từ tối thiểu đến tối đa), đây có thể là độ biến thiên nhỏ nhất có thể được mong đợi.

Sản phẩm liên quan:

Bộ RT qPCR trực tiếp cho tế bào

Bộ kit PCR trực tiếp đuôi chuột

Bộ kit PCR trực tiếp mô động vật