RT-qPCR là thí nghiệm cơ bản của sinh học phân tử và chắc hẳn mọi người đã quá quen thuộc với nó.Nó chủ yếu bao gồm ba bước: chiết xuất RNA, sao chép ngược thành cDNA và PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực.Nó không giúp được gì, chuyện gì đang xảy ra vậy?Có khả năng là có một vấn đề vớithí nghiệm phiên mã ngược!Mặc dù có vẻ như thí nghiệm phiên mã ngược chỉ cần thêm RNA, dNTP, đoạn mồi vàphiên mã ngượcvào ống ly tâm và trộn đều, tuy nhiên trong quá trình vận hành thực tế vẫn còn nhiều chi tiết cần lưu ý.Hãy cùng tìm hiểu về nó nhé!

Làm thế nào để đánh giá chất lượng của RNA?
Để có được cDNA, chất lượng của RNA là rất quan trọng!Chất lượng RNA có thể được phát hiện chủ yếu từ hai khía cạnh:
(1) Tính toàn vẹn của RNA:Tính toàn vẹn của RNA có thể được xác minh bằng điện di trên gel agarose. Lấy sinh vật nhân chuẩn làm ví dụ, RNA tổng số hoàn chỉnh có ba dải rõ ràng, trọng lượng phân tử từ lớn đến nhỏ là 28S, 18S và 5S, 28S sáng gấp đôi 18S;nếu có thể nhìn thấy ba dải, nhưng loại dải bị mờ hoặc Khuếch tán có nghĩa là RNA bị phân hủy một phần.Lúc này, hãy thực hiện phản ứng sao chép ngược ngay lập tức và tăng cường đầu vào tiêu bản một cách hợp lý;nếu chỉ thấy dải có trọng lượng phân tử nhỏ hoặc không thấy dải nào thì ARN đã bị phân hủy hoàn toàn và cần được chiết tách lại.Agilent 2100 chỉ ra tính toàn vẹn của RNA với sơ đồ đỉnh và giá trị RIN.Nếu axit nucleic còn nguyên vẹn, đường cơ sở của điện di đồ phẳng;nếu axit nucleic bị phân hủy nghiêm trọng, đường nền không đồng đều và xuất hiện nhiều đỉnh phân hủy hơn;giá trị của RIN phản ánh tính toàn vẹn của RNA, nằm trong khoảng từ 0-10, giá trị này càng lớn thì chất lượng của RNA càng tốt.Vâng, mức độ đầy đủ càng cao.
(2) Độ tinh khiết của RNA:Tỷ lệ OD260/280 có thể được phát hiện bằng phép đo quang phổ UV .Nếu tỷ lệ OD260/280 nằm trong khoảng từ 1,9 đến 2,1 thì độ tinh khiết rất tốt.
DNA bộ gen còn sót lại có thể dẫn đến kết quả định lượng không chính xác
Khi RNA được chiết xuất, RNA mà chúng ta thu được có thể bị trộn lẫn với DNA bộ gen (gDNA) chưa được làm sạch.Do đó, cDNA sau phiên mã ngược cũng sẽ được trộn lẫn vớigDNA.Trong thời gian hạ lưuqPCRsự phản ứng lại,cADNvà gDNA có thể được khuếch đại đồng thời, dẫn đến giá trị CT tương đối nhỏ, vì vậy kết quả có thể bị sai lệch.
Vậy chúng ta nên làm gì trong tình huống này?tiền thângợi ý:
(1) Thực hiện làm sạch bộ gen trên RNA đảo ngược, có thể được loại bỏ bằng cách chiết xuất cột trong quá trình chiết xuất RNA;
(2) Xử lý RNA chiết xuất bằng DNaseI , nhưng kết thúc nó bằng EDTA;
thuốc thử phiên mã ngượcvới các mô-đun xóa bộ gen;

Cách chọn mồi để phiên mã ngược?
Mồi phiên mã ngược cũng ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng phiên mã ngược.Có thể chọn đoạn mồi ngẫu nhiên, đoạn mồi Oligo dT hoặc đoạn mồi đặc hiệu của gen để phiên mã ngược tùy theo hoàn cảnh cụ thể của thí nghiệm:
(1) Bảng điểm cụ thể: nên sử dụng mồi dành riêng cho gen;
(2) Bản ghi đoạn dài: Nên sử dụng mồi Oligo dT/dành riêng cho gen;
(3) Các đoạn bên trong của bảng điểm dài: đoạn mồi đặc hiệu gen/đoạn mồi ngẫu nhiên/đoạn mồi ngẫu nhiên + Oligo dT.Nếu thử nghiệm qPCR tiếp theo được thực hiện, thì không thể sử dụng Oligo dT một mình vì chỉ sử dụng Oligo dT có thể gây ra sai lệch 3′ đầu , dẫn đến kết quả thử nghiệm qPCR không chính xác;
(4) miARN: Có thể sử dụng sơn lót vòng gốc hoặc sơn lót đuôi.

Cần pha loãng sản phẩm phiên mã ngược cDNA bao nhiêu lần để định lượng?
Sau khi thu được cDNA của sản phẩm phiên mã ngược, cDNA nên được pha loãng bao nhiêu lần cho các thí nghiệm qPCR là rất quan trọng.Nếu nồng độ cDNA quá cao hoặc quá thấp, hiệu quả khuếch đại có thể bị ảnh hưởng.Có thể đo nồng độ cDNA không và nên thực hiện như thế nào?
(1) Không thể đo nồng độ cDNA của sản phẩm phiên mã ngược, vì ngoài sản phẩm cDNA, sản phẩm sao chép ngược còn chứa Buffer phiên mã ngược, enzyme phiên mã ngược, đoạn mồi, v.v., sẽ cản trở kết quả đo nồng độ và gây ra tỷ lệ OD260/280, OD260/230 bất thường và do đó không phản ánh hiệu suất cDNA thực sự.Lúc này, một số bạn sẽ nói, sau đó tôi sẽ đo nồng độ sau khi thanh lọc;ở đây, Foregene muốn nhắc nhở rằng cDNA không được khuyến nghị tinh sạch, vì độ dài của cDNA thu được từ quá trình đảo ngược là khác nhau và cDNA ngắn sẽ bị mất trong quá trình tinh sạch.
(2) Vậy phải làm sao?Trước khi thử nghiệm qPCR, độ dốc pha loãng của cDNA có thể được xác định thông qua thử nghiệm trước .Ví dụ: sử dụng dung dịch gốc cDNA, độ pha loãng 10 lần và độ pha loãng 100 lần làm mẫu cho các thử nghiệm qPCR và chọn hệ số pha loãng có giá trị CT trong khoảng 18-28.

Các miRNA nên được phiên mã ngược như thế nào?
miRNA là RNA phân tử nhỏ sợi đơn có kích thước khoảng 22 nt không mã hóa cho protein.Do độ dài ngắn nên phương pháp qPCR thông thường khó định lượng trực tiếp nó, do đó thường cần phải mở rộng miRNA;các phương pháp phiên mã ngược thường được sử dụng cho miRNA bao gồm phương pháp vòng lặp gốc và phương pháp đuôi.
Phương pháp vòng lặp gốc là mở rộng miRNA bằng cách thêm đoạn mồi vòng lặp gốc.Phương pháp phát hiện này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, nhưng thông lượng phát hiện thấp.Một phiên mã ngược chỉ có thể phát hiện một miRNA và một tham chiếu nội bộ;phương pháp thêm đuôi bao gồm hai. Nó được hoàn thành nhờ hoạt động chung của hai enzym, đó là PolyA polymerase và enzym phiên mã ngược.PolyA polymerase chịu trách nhiệm thêm các đuôi PolyA vào miRNA để tăng chiều dài của nó, và enzyme phiên mã ngược thực hiện phản ứng phiên mã ngược.Phương pháp này có thông lượng phát hiện cao và có thể phát hiện nhiều miRNA và tham chiếu bên trong trong một lần phiên mã ngược, nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu thấp trong phương pháp vòng lặp gốc.