Real Time PCR, còn được gọi là PCR định lượng hoặc qPCR, là phương pháp theo dõi và phân tích thời gian thực các sản phẩm khuếch đại PCR.
Do PCR định lượng có ưu điểm là thao tác đơn giản, nhanh chóng và thuận tiện, độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và tỷ lệ nhiễm thấp nên được sử dụng rộng rãi trong xét nghiệm y tế, đánh giá hiệu quả của thuốc, nghiên cứu biểu hiện gen, nghiên cứu chuyển gen, phát hiện gen, phát hiện mầm bệnh, phát hiện động vật và thực vật., thử nghiệm thực phẩm và các lĩnh vực khác.
Do đó, cho dù bạn đang làm nghiên cứu cơ bản về khoa học đời sống, hay nhân viên của các công ty dược phẩm, công ty chăn nuôi, công ty thực phẩm, hay thậm chí là nhân viên của cục kiểm tra xuất nhập cảnh, cục quan trắc môi trường, bệnh viện và các đơn vị khác, bạn sẽ ít nhiều tiếp xúc với Hoặc bạn cần biết kiến ​​thức thành thạo PCR định lượng.

Nguyên lý PCR thời gian thực

PCR thời gian thực là phương pháp trong đó các chất huỳnh quang được thêm vào hệ thống phản ứng PCR và cường độ tín hiệu huỳnh quang trong quá trình phản ứng PCR được theo dõi trong thời gian thực bằng thiết bị PCR định lượng và cuối cùng dữ liệu thử nghiệm được phân tích và xử lý.

【đường cong khuếch đại】là đường cong mô tả quá trình động của PCR.Đường cong khuếch đại của PCR thực tế không phải là đường cong hàm mũ tiêu chuẩn, mà là đường cong sigmoid.

[Giai đoạn nền tảng của đường cong khuếch đại]Với sự gia tăng số lượng chu kỳ PCR, sự bất hoạt của DNA polymerase, sự cạn kiệt của dNTP và mồi, và sự ức chế phản ứng tổng hợp bởi sản phẩm phụ pyrophosphate của phản ứng, v.v., PCR không phải lúc nào cũng mở rộng theo cấp số nhân., và cuối cùng sẽ đi vào một cao nguyên.

[Vùng tăng trưởng theo cấp số nhân của đường cong khuếch đại]Mặc dù pha cao nguyên thay đổi rất nhiều, nhưng ở một vùng nhất định của vùng tăng trưởng theo cấp số nhân của đường cong khuếch đại, độ lặp lại rất tốt, điều này rất quan trọng đối với phân tích định lượng PCR.

[Giá trị ngưỡng và giá trị Ct]Chúng tôi đặt giá trị giới hạn phát hiện huỳnh quang tại vị trí thích hợp trong vùng tăng trưởng hàm mũ của đường cong khuếch đại, cụ thể là giá trị ngưỡng (Threshold).Giao điểm của giá trị ngưỡng và đường cong khuếch đại là giá trị Ct, nghĩa là giá trị Ct đề cập đến số chu kỳ (Chu kỳ ngưỡng) khi đạt đến giá trị ngưỡng.

Đồ thị dưới đây thể hiện rõ mối quan hệ giữa đường ngưỡng và đường cong khuếch đại, ngưỡng và giá trị Ct.

【Làm thế nào để định lượng?】

Nó đã được chứng minh bằng lý thuyết toán học rằng giá trị Ct có mối quan hệ tuyến tính nghịch đảo với logarit của số mẫu ban đầu.Real Time PCR giám sát các sản phẩm khuếch đại PCR trong thời gian thực và định lượng chúng trong giai đoạn khuếch đại hàm mũ.

Đối với mỗi chu kỳ PCR, DNA tăng gấp 2 lần theo cấp số nhân và nhanh chóng đạt đến mức ổn định.

Giả sử số lượng ADN ban đầu là A₀ , sau n chu kỳ, lượng sản phẩm DNA lý thuyết có thể được biểu thị là:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Khi đó, lượng DNA ban đầu A 0 càng nhiều thì lượng sản phẩm khuếch đại càng sớm đạt đến giá trị phát hiện An, và số chu kỳ khi đạt đến An chính là giá trị Ct.Nghĩa là, lượng DNA ban đầu A 0 càng nhiều thì các đỉnh của đường cong khuếch đại càng sớm và tương ứng số chu kỳ n cần thiết càng nhỏ.

Chúng tôi tiến hành pha loãng gradient của chất chuẩn có nồng độ đã biết và sử dụng nó làm khuôn mẫu cho PCR thời gian thực và một loạt các đường cong khuếch đại sẽ thu được ở các khoảng thời gian bằng nhau theo thứ tự lượng DNA bắt đầu từ nhiều hơn đến ít hơn.Theo mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị Ct và logarit của số mẫu bắt đầu, a[đường chuẩn] có thể được tạo.

Bằng cách thay thế giá trị Ct của mẫu có nồng độ chưa biết vào đường chuẩn, có thể thu được lượng khuôn mẫu ban đầu của mẫu có nồng độ chưa biết, đây là nguyên tắc định lượng của Real Time PCR.

Phương pháp phát hiện Real Time PCR

Real Time PCR phát hiện các sản phẩm khuếch đại PCR bằng cách phát hiện cường độ huỳnh quang trong hệ thống phản ứng.

Nguyên tắc của phương pháp nhúng thuốc nhuộm huỳnh quang】

thuốc nhuộm huỳnh quang, chẳng hạn như TB Green ® , có thể liên kết không đặc hiệu với DNA sợi kép trong hệ thống PCR và phát huỳnh quang khi liên kết.

Cường độ huỳnh quang trong hệ thống phản ứng tăng theo cấp số nhân với sự gia tăng của chu kỳ PCR.Bằng cách phát hiện cường độ huỳnh quang, lượng khuếch đại DNA trong hệ thống phản ứng có thể được theo dõi trong thời gian thực, sau đó lượng mẫu ban đầu trong mẫu có thể được ước tính ngược lại.

【Nguyên lý của phương pháp dò huỳnh quang】

đầu dò huỳnh quanglà trình tự axit nucleic có nhóm huỳnh quang ở đầu 5′ và nhóm dập tắt ở đầu 3′, nhóm này có thể liên kết đặc hiệu với mẫu.Khi đầu dò còn nguyên vẹn, huỳnh quang phát ra từ fluorophore bị dập tắt bởi nhóm dập tắt và không thể phát huỳnh quang.Khi đầu dò bị phân hủy, chất huỳnh quang sẽ phân ly và phát ra huỳnh quang.

Một đầu dò huỳnh quang được thêm vào dung dịch phản ứng PCR.Trong quá trình ủ, đầu dò huỳnh quang sẽ liên kết với vị trí cụ thể của tiêu bản.Trong quá trình kéo dài, hoạt tính exonuclease 5′→3′ của enzyme PCR có thể phân hủy mẫu dò huỳnh quang được lai với mẫu và chất huỳnh quang được phân tách để phát ra huỳnh quang.Bằng cách phát hiện cường độ huỳnh quang của đầu dò trong hệ thống phản ứng, có thể đạt được mục đích theo dõi lượng khuếch đại của sản phẩm PCR.

【Lựa chọn phương pháp phát hiện huỳnh quang】

Nếu nó được sử dụng để phân biệt các trình tự có tính tương đồng cao và thực hiện PCR phát hiện multiplex như phân tích kiểu SNP, thì phương pháp thăm dò huỳnh quang là không thể thay thế.
Đối với các thí nghiệm PCR thời gian thực khác, có thể sử dụng phương pháp chimera huỳnh quang đơn giản, dễ dàng và chi phí thấp.

đầu dò có tính đặc hiệu cao, có khả năng multiplex PCR

Sự thiếu sót

Yêu cầu độ đặc hiệu cao để khuếch đại;

không thực hiện được multiplex PCR Cần thiết kế mẫu dò đặc hiệu, giá thành cao;

đôi khi thiết kế thăm dò là khó khăn

Những sảm phẩm tương tự: