Trong các thí nghiệm qPCR, thiết kế primer cũng là một mắt xích rất quan trọng.Mồi có phù hợp hay không có liên quan mật thiết đến hiệu quả khuếch đại có đạt tiêu chuẩn hay không, sản phẩm khuếch đại có đặc hiệu hay không và có kết quả thực nghiệm hay không.
Vậy làm thế nào để làm cho tính đặc hiệu của mồi qPCR tốt hơn?Hiệu suất khuếch đại cao?
Hôm nay, chúng tôi sẽ đưa bạn cùng nhau thiết kế đoạn mồi qPCR và để thiết kế đoạn mồi qPCR trở thành một kỹ năng truyền thuyết hiệu quả trong các thí nghiệm.
Khi thiết kế đoạn mồi qPCR, thường chú ý đến các điểm sau: đoạn mồi phải được thiết kế càng nhiều intron càng tốt, chiều dài sản phẩm phải là 100-300 bp, giá trị Tm phải càng gần 60°C càng tốt, và đoạn mồi ngược dòng và xuôi dòng phải càng gần càng tốt, và phần cuối của đoạn mồi phải là G hoặc C, v.v. chờ đã.
1. Thiết kế các đoạn mồi kéo dài intron
Khi thiết kế các đoạn mồi qPCR, việc chọn các đoạn mồi được thiết kế trên các intron có thể ngăn không cho mẫu gDNA được khuếch đại và tất cả các sản phẩm đều được tạo ra từ quá trình khuếch đại cDNA, do đó loại bỏ ảnh hưởng của việc nhiễm gDNA.
2. chiều dài sơn lót
Độ dài mồi thường nằm trong khoảng 18-30 nt và độ dài của sản phẩm khuếch đại phải được kiểm soát trong khoảng 100-300 bp càng nhiều càng tốt.
Nếu mồi quá ngắn sẽ dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu, còn nếu quá dài sẽ dễ hình thành cấu trúc thứ cấp (chẳng hạn như cấu trúc kẹp tóc).Nếu sản phẩm khuếch đại để quá lâu sẽ không thích hợp cho phản ứng của polymerase, sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình khuếch đại PCR.
3. Hàm lượng GC và giá trị Tm
Hàm lượng GC của mồi nên được kiểm soát trong khoảng từ 40% đến 60%.Nếu quá cao hoặc quá thấp đều không có lợi cho việc bắt đầu phản ứng.Hàm lượng GC của mồi thuận và mồi nghịch phải gần giống nhau để thu được cùng giá trị Tm và nhiệt độ ủ.
Giá trị Tm phải ở trong khoảng 55-65°C càng xa càng tốt, thường là khoảng 60°C và giá trị Tm của thượng nguồn và hạ nguồn phải càng gần càng tốt, tốt nhất là không quá 4°C.
4. Tránh chọn A ở đầu 3′ của mồi
Khi đầu 3′ của mồi không khớp, sẽ có sự khác biệt lớn về hiệu quả tổng hợp của các bazơ khác nhau.Khi cơ sở cuối cùng là A, nó cũng có thể bắt đầu quá trình tổng hợp chuỗi ngay cả trong trường hợp không khớp và khi cơ sở cuối cùng là T Khi , hiệu quả của cảm ứng không khớp giảm đi rất nhiều.Do đó, cố gắng tránh chọn A ở cuối 3′ của primer, và tốt hơn là chọn T.
Nếu đó là đoạn mồi đầu dò, đầu 5′ của đầu dò không thể là G, bởi vì ngay cả khi một gốc G duy nhất được kết nối với nhóm phóng huỳnh quang FAM, G cũng có thể dập tắt tín hiệu huỳnh quang do nhóm FAM phát ra, dẫn đến kết quả âm tính giả.Xuất hiện.
5. phân phối cơ sở
Sự phân bố của 4 bazơ trong đoạn mồi tốt nhất là ngẫu nhiên, tránh quá 3 G hoặc C liên tiếp ở đầu 3′ và hơn 3 liên tiếpG hoặc C dễ tạo cặp trong vùng trình tự giàu GC.
6. Vùng thiết kế mồi nên tránh các cấu trúc thứ cấp phức tạp.
Cấu trúc thứ cấp được hình thành bởi sợi đơn của sản phẩm khuếch đại sẽ ảnh hưởng đến tiến trình PCR suôn sẻ.Bằng cách dự đoán trước liệu có cấu trúc thứ cấp trong trình tự mục tiêu hay không, hãy cố gắng tránh vùng này trong thiết kế mồi.
7. Bản thân các mồi và giữa các mồi nên cố gắng tránh các bazơ bổ sung liên tiếp.
Không thể có sự bổ sung 4 bazơ liên tiếp giữa bản thân mồi và mồi.Bản thân mồi không được có trình tự bổ sung, nếu không nó sẽ tự gấp lại để tạo thành cấu trúc kẹp tóc, điều này sẽ ảnh hưởng đến sự kết hợp ủ của mồi và khuôn.
Các trình tự bổ sung không thể tồn tại giữa các đoạn mồi ngược dòng và xuôi dòng.Sự bổ sung giữa các primer sẽ tạo ra primer dimer, điều này sẽ làm giảm hiệu quả PCR và thậm chí ảnh hưởng đến độ chính xác định lượng.Nếu cấu trúc mồi-dimer và kẹp tóc là không thể tránh khỏi, thì giá trị △G không được quá cao (nên nhỏ hơn 4,5 kcal/mol).
8. Các mồi khuếch đại sản phẩm cụ thể mục tiêu.
Mục tiêu cuối cùng của phát hiện qPCR là hiểu được sự phong phú của gen mục tiêu.Nếu xảy ra hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu thì việc định lượng sẽ không chính xác.Do đó, sau khi các đoạn mồi được thiết kế, chúng cần được kiểm tra bằng BLAST và tính đặc hiệu của các sản phẩm được so sánh trong cơ sở dữ liệu trình tự.
Tiếp theo, chúng tôi lấy gen GAS6 (6) của con người làm ví dụ để thiết kế đoạn mồi qPCR.
01 gen truy vấn
Homo GAS6thông qua NCBI.Ở đây, chúng ta nên chú ý đến việc so sánh tên gen và loài để đảm bảo rằng chúng phù hợp.
02 Tìm trình tự gen
(1) Nếu trình tự mục tiêu là DNA bộ gen, hãy chọn trình tự đầu tiên, là trình tự DNA bộ gen của gen.
(2) Nếu trình tự mục tiêu là mRNA, hãy chọn trình tự thứ hai.Sau khi nhập, nhấp vào “CDS” trong bảng bên dưới.Trình tự nền màu nâu là trình tự mã hóa của gen.
03 Sơ đồ thiết kế
Vào giao diện Primer-BLAST
Nhập số trình tự gen hoặc trình tự ở định dạng Fasta ở phía trên bên trái và điền các thông số liên quan.

Nhấp vào “Nhận đoạn mồi” và NCBI sẽ bật lên để cho bạn biết rằng lựa chọn tham số như vậy sẽ được khuếch đại cho các biến thể nối khác.Chúng tôi có thể kiểm tra các biến thể ghép nối khác nhau và gửi chúng để có được cặp mồi thích hợp (như trong hình bên dưới).Quá trình này có thể mất hàng chục giây để chạy.
Nhiệt độ ủ của các cặp mồi này đều ở khoảng 60°C.Theo mục đích của thí nghiệm, chọn mồi có độ dài vừa phải, độ đặc hiệu tốt và ít mồi tự bổ sung cho thí nghiệm, tỷ lệ thành công khá cao!
04Xác minh tính đặc hiệu của primer
Trên thực tế, ngoài việc thiết kế mồi, Primer-Blast còn có thể đánh giá mồi do chúng tôi tự thiết kế.Quay lại trang thiết kế mồi, nhập các mồi ngược dòng và xuôi dòng mà chúng tôi đã thiết kế và các thông số khác sẽ không được điều chỉnh.Sau khi gửi, bạn có thể xem liệu cặp mồi có tồn tại trên các gen khác hay không.Nếu tất cả chúng đều được hiển thị trên gen mà chúng ta muốn khuếch đại, chứng tỏ độ đặc hiệu của cặp mồi này là rất lớn!(Ví dụ: đây là kết quả duy nhất của truy vấn mồi!)

05 Đánh giá chất lượng sơn lót
Loại mồi nào là mồi “hoàn hảo” kết hợp giữa “hiệu suất khuếch đại đạt tiêu chuẩn”, “đặc tính của sản phẩm được khuếch đại” và “kết quả thử nghiệm đáng tin cậy”?
hiệu quả khuếch đại

đường cong nóng chảy
Hiệu suất khuếch đại của mồi đạt 90% -110%, nghĩa là hiệu suất khuếch đại tốt, đường cong nóng chảy có một đỉnh duy nhất và thường Tm>80°C, nghĩa là độ đặc hiệu khuếch đại tốt.
 
Những sảm phẩm tương tự:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman