• PCR là phương pháp được sử dụng để khuếch đại DNA từ một lượng nhỏ mẫu DNA.RT-PCR sử dụng phiên mã ngược để tạo ra mẫu DNA từ nguồn RNA mà sau đó có thể được khuếch đại.
• PCR và RT-PCR thường là các phản ứng điểm cuối, trong khi qPCR và RT-qPCR sử dụng động học của tốc độ tổng hợp sản phẩm trong phản ứng PCR để định lượng lượng mẫu có mặt.
• Các phương pháp mới hơn, chẳng hạn như PCR kỹ thuật số, cung cấp định lượng tuyệt đối mẫu DNA ban đầu, trong khi các phương pháp như PCR đẳng nhiệt giúp giảm nhu cầu về thiết bị đắt tiền để cung cấp kết quả đáng tin cậy.

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử tương đối đơn giản và được sử dụng rộng rãi để khuếch đại và phát hiện trình tự DNA và RNA.So với các phương pháp nhân bản và khuếch đại DNA truyền thống thường mất nhiều ngày thì PCR chỉ cần vài giờ.PCR có độ nhạy cao và yêu cầu mẫu tối thiểu để phát hiện và khuếch đại các trình tự cụ thể.Các phương pháp PCR cơ bản đã tiến bộ hơn nữa từ phương pháp phát hiện DNA và RNA đơn giản.Dưới đây, chúng tôi đã cung cấp thông tin tổng quan về các phương pháp PCR khác nhau và thuốc thử mà chúng tôi cung cấp tại Enzo Life Sciences để đáp ứng nhu cầu nghiên cứu của bạn.Chúng tôi mong muốn giúp các nhà khoa học nhanh chóng tiếp cận thuốc thử PCR để sử dụng cho dự án nghiên cứu tiếp theo của họ!

PCR

Đối với PCR tiêu chuẩn, tất cả những gì bạn cần là DNA polymerase, magie, nucleotide, mồi, mẫu DNA cần khuếch đại và máy điều nhiệt.Cơ chế PCR đơn giản như mục đích của nó: 1) DNA chuỗi kép (dsDNA) bị biến tính nhiệt, 2) các đoạn mồi sắp xếp thẳng hàng với các chuỗi DNA đơn và 3) các đoạn mồi được mở rộng nhờ DNA polymerase, tạo ra hai bản sao của DNA. sợi DNA ban đầu.Quá trình biến tính, ủ và kéo dài qua một loạt nhiệt độ và thời gian được gọi là một chu kỳ khuếch đại (Hình 1).

Mỗi bước của chu trình phải được tối ưu hóa cho mẫu và bộ mồi được sử dụng.Chu trình này được lặp lại khoảng 20-40 lần và sản phẩm khuếch đại sau đó có thể được phân tích, điển hình là bằng gel agarose (Hình 2).

Vì PCR là một phương pháp có độ nhạy cao và cần thể tích rất nhỏ cho các phản ứng đơn lẻ, nên việc chuẩn bị hỗn hợp chính cho một số phản ứng được khuyến khích.Hỗn hợp gốc phải được trộn đều rồi chia theo số lượng phản ứng, đảm bảo mỗi phản ứng sẽ chứa cùng một lượng enzyme, dNTP và mồi.Nhiều nhà cung cấp, chẳng hạn như Enzo Life Sciences, cũng cung cấp hỗn hợp PCR đã chứa mọi thứ ngoại trừ mồi và mẫu DNA.

Vùng giàu Guanine/Cytosine (giàu GC) là một thách thức trong kỹ thuật PCR tiêu chuẩn.Trình tự giàu GC ổn định hơn trình tự có hàm lượng GC thấp hơn.Hơn nữa, các trình tự giàu GC có xu hướng hình thành các cấu trúc thứ cấp, chẳng hạn như các vòng kẹp tóc.Kết quả là, sợi đôi giàu GC khó tách hoàn toàn trong giai đoạn biến tính.Do đó, DNA polymerase không thể tổng hợp chuỗi mới mà không gặp trở ngại.Nhiệt độ biến tính cao hơn có thể cải thiện điều này và việc điều chỉnh theo nhiệt độ ủ cao hơn và thời gian ủ ngắn hơn có thể ngăn chặn sự liên kết không đặc hiệu của mồi giàu GC.Thuốc thử bổ sung có thể tăng cường khuếch đại trình tự giàu GC.DMSO, glycerol và betaine giúp phá vỡ các cấu trúc thứ cấp gây ra bởi tương tác GC và do đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách các chuỗi kép.

PCR khởi động nóng

Khuếch đại không đặc hiệu là một vấn đề có thể xảy ra trong quá trình PCR.Hầu hết các DNA polymerase được sử dụng cho PCR hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ khoảng 68°C đến 72°C.Tuy nhiên, enzyme này cũng có thể hoạt động ở nhiệt độ thấp hơn, mặc dù ở mức độ thấp hơn.Ở nhiệt độ thấp hơn nhiều so với nhiệt độ ủ, mồi có thể liên kết không đặc hiệu và dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu, ngay cả khi phản ứng được thiết lập trên băng.Điều này có thể được ngăn chặn bằng cách sử dụng các chất ức chế polymerase chỉ tách khỏi DNA polymerase khi đạt đến nhiệt độ nhất định, do đó có thuật ngữ PCR khởi động nóng.Chất ức chế có thể là một kháng thể liên kết với polymerase và biến tính ở nhiệt độ biến tính ban đầu (thường là 95°C).

Polymerase có độ trung thực cao

Trong khi DNA polymerase khuếch đại khá chính xác theo trình tự mẫu ban đầu, vẫn có thể xảy ra lỗi trong việc kết hợp nucleotide.Sự không khớp trong các ứng dụng như nhân bản có thể dẫn đến các bản phiên mã bị cắt ngắn và các protein bị dịch sai hoặc không hoạt động ở hạ lưu.Để tránh những sự không khớp này, các polymerase có hoạt động “đọc hiệu đính” đã được xác định và đưa vào quy trình làm việc.Polymerase hiệu đính đầu tiên, Pfu, được xác định vào năm 1991 ở Pyrococcus furiosus.Enzim Pfu này có hoạt tính exonuclease từ 3' đến 5'.Khi DNA được khuếch đại, exonuclease sẽ loại bỏ các nucleotide không khớp ở đầu 3' của sợi.Sau đó, nucleotide chính xác sẽ được thay thế và quá trình tổng hợp DNA tiếp tục.Việc xác định trình tự nucleotide không chính xác dựa trên ái lực liên kết của nucleoside triphosphate chính xác với enzyme, trong đó liên kết không hiệu quả sẽ làm chậm quá trình tổng hợp và cho phép thay thế chính xác.Hoạt động hiệu đính của Pfu polymerase dẫn đến ít lỗi hơn ở trình tự cuối cùng so với Taq DNA polymerase.Trong những năm gần đây, các enzyme hiệu đính khác đã được xác định và việc sửa đổi enzyme Pfu ban đầu đã được thực hiện để giảm hơn nữa tỷ lệ lỗi trong quá trình khuếch đại DNA.

RT-PCR

PCR phiên mã ngược, hay RT-PCR, cho phép sử dụng RNA làm mẫu.Một bước bổ sung cho phép phát hiện và khuếch đại RNA.RNA được phiên mã ngược thành DNA bổ sung (cDNA), sử dụng enzyme phiên mã ngược.Chất lượng và độ tinh khiết của mẫu RNA là điều cần thiết cho sự thành công của RT-PCR.Bước đầu tiên của RT-PCR là tổng hợp DNA/RNA lai.Enzyme phiên mã ngược cũng có chức năng RNase H, làm suy giảm phần RNA của giống lai.Phân tử DNA chuỗi đơn sau đó được hoàn thiện nhờ hoạt động DNA polymerase phụ thuộc DNA của enzyme phiên mã ngược thành cDNA.Hiệu suất của phản ứng sợi đầu tiên có thể ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại.Từ đây trở đi, quy trình PCR tiêu chuẩn được sử dụng để khuếch đại cDNA.Khả năng biến RNA thành cDNA bằng RT-PCR có nhiều ưu điểm và nó chủ yếu được sử dụng để phân tích biểu hiện gen.RNA là chuỗi đơn và rất không ổn định, điều này gây khó khăn khi làm việc.Nó thường đóng vai trò là bước đầu tiên trong qPCR, giúp định lượng bản phiên mã RNA trong mẫu sinh học.

qPCR và RT-qPCR

PCR định lượng (qPCR) được sử dụng để phát hiện, mô tả và định lượng axit nucleic cho nhiều ứng dụng.Trong RT-qPCR, các bản phiên mã RNA thường được định lượng bằng cách sao chép ngược chúng thành cDNA trước tiên, như mô tả ở trên, sau đó qPCR được thực hiện.Như trong PCR tiêu chuẩn, DNA được khuếch đại bằng ba bước lặp lại: biến tính, ủ và kéo dài.Tuy nhiên, trong qPCR, ghi nhãn huỳnh quang cho phép thu thập dữ liệu khi tiến hành PCR.Kỹ thuật này có nhiều lợi ích do có nhiều phương pháp và hóa chất sẵn có.

Trong qPCR dựa trên thuốc nhuộm (thường là màu xanh lá cây), ghi nhãn huỳnh quang cho phép định lượng các phân tử DNA được khuếch đại bằng cách sử dụng thuốc nhuộm liên kết DSDNA.Trong mỗi chu kỳ, huỳnh quang được đo.Tín hiệu huỳnh quang tăng tỷ lệ thuận với lượng DNA được sao chép.Do đó, DNA được định lượng theo “thời gian thực” (Hình 3).Nhược điểm của qPCR dựa trên thuốc nhuộm là mỗi lần chỉ có thể kiểm tra một mục tiêu và thuốc nhuộm sẽ liên kết với bất kỳ ds-DNA nào có trong mẫu.

Trong qPCR dựa trên đầu dò, nhiều mục tiêu có thể được phát hiện đồng thời trong mỗi mẫu, nhưng điều này đòi hỏi phải tối ưu hóa và thiết kế (các) đầu dò dành riêng cho mục tiêu được sử dụng cùng với mồi.Hiện có một số loại thiết kế đầu dò, nhưng loại phổ biến nhất là đầu dò thủy phân, kết hợp chất huỳnh quang và chất khử.Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) ngăn chặn sự phát xạ của fluorophore qua chất khử chất khử trong khi đầu dò còn nguyên vẹn.Tuy nhiên, trong quá trình phản ứng PCR, đầu dò bị thủy phân trong quá trình kéo dài mồi và khuếch đại trình tự cụ thể mà nó liên kết.Sự phân tách của đầu dò tách chất fluorophore khỏi chất khử chất khử và dẫn đến sự gia tăng huỳnh quang phụ thuộc vào khuếch đại (Hình 4).Do đó, tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng qPCR dựa trên đầu dò tỷ lệ thuận với lượng trình tự mục tiêu thăm dò có trong mẫu.Bởi vì qPCR dựa trên đầu dò đặc hiệu hơn qPCR dựa trên thuốc nhuộm nên nó thường là công nghệ được sử dụng trong các xét nghiệm chẩn đoán dựa trên qPCR.

Khuếch đại đẳng nhiệt

Kỹ thuật PCR được đề cập ở trên đòi hỏi thiết bị điều nhiệt đắt tiền để tăng và giảm nhiệt độ buồng một cách chính xác cho các bước biến tính, ủ và mở rộng.Một số kỹ thuật đã được phát triển mà không cần các thiết bị chính xác như vậy và có thể được thực hiện trong bể nước đơn giản hoặc thậm chí trong các tế bào quan tâm.Các kỹ thuật này được gọi chung là khuếch đại đẳng nhiệt và hoạt động dựa trên khuếch đại theo cấp số nhân, tuyến tính hoặc theo tầng.

Loại khuếch đại đẳng nhiệt được biết đến nhiều nhất là khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng, hay LAMP.LAMP sử dụng khuếch đại theo cấp số nhân ở 65⁰C để khuếch đại DNA hoặc RNA mẫu.Khi thực hiện LAMP, bốn đến sáu đoạn mồi bổ sung cho các vùng của DNA mục tiêu được sử dụng cùng với DNA polymerase để tổng hợp DNA mới.Hai trong số các đoạn mồi này có các trình tự bổ sung giúp nhận biết các trình tự trong các đoạn mồi khác và liên kết chúng, cho phép hình thành cấu trúc “vòng lặp” trong DNA mới được tổng hợp, sau đó hỗ trợ quá trình ủ mồi trong các vòng khuếch đại tiếp theo.LAMP có thể được hiển thị bằng nhiều phương pháp, bao gồm huỳnh quang, điện di trên gel agarose hoặc đo màu.Sự dễ dàng hình dung và phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của sản phẩm bằng phép đo màu và việc thiếu thiết bị đắt tiền cần thiết đã khiến LAMP trở thành một lựa chọn phù hợp để xét nghiệm SARS-CoV-2 ở những khu vực không có sẵn xét nghiệm trong phòng thí nghiệm lâm sàng hoặc bảo quản và vận chuyển mẫu là không khả thi hoặc trong các phòng thí nghiệm trước đây không có thiết bị điều hòa nhiệt độ PCR.