Các phiên mã ngược truyền thống không thể chịu được nhiệt độ cao (nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của MMLV là 37-50°C và AMV là 42-60°C).RNA virus phức tạp hơn không thể được phiên mã ngược một cách hiệu quả thành cDNA ở nhiệt độ thấp, dẫn đến hiệu quả phát hiện Giảm.RT-qPCR truyền thống thường yêu cầu sự tham gia của hai enzyme chính (reverse transcriptase và DNA polymerase), điều này khiến cho việc đơn giản hóa hoạt động của hệ thống phản ứng và giảm chi phí là không thể.Ở đây chúng tôi sẽ giới thiệu hai phiên mã ngược chịu nhiệt độ cao là TtH và RevTaq.Hai enzym này cũng có chức năng của DNA polymerase nên được gọi là enzym nhị chức.

DNA polymerase TtH

Bạn hẳn đã nghe nói về TtH, nó có nguồn gốc từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus thermophilus HB8.Với sự có mặt của các cation hóa trị hai như Mg2+, nó có hoạt tính DNA polymerase.Nó được sử dụng rộng rãi trong phản ứng PCR giống như enzyme Taq, tuy nhiên nó có khả năng chịu nhiệt cao hơn enzyme Taq nên cũng cho hiệu quả PCR tốt hơn với tiêu bản hàm lượng GC cao.

· Enzyme này về cơ bản không có hoạt tính exonuclease 3′→5′ và hoạt tính exonuclease 5′→3′, vì vậy nó cũng có thể được sử dụng để giải trình tự dideoxy.

· Enzyme này có hoạt tính RTase.Với sự có mặt của Mn2+, hoạt động của RTase sẽ được tăng cường.Sử dụng tính năng này, nó có thể được sử dụng để thực hiện phản ứng sao chép ngược và phản ứng PCR trong cùng một ống, tức là RT-PCR một bước.Tuy nhiên, với sự có mặt của Mn2+, độ chính xác của RT-PCR không cao.Hoạt động RT không liên quan gì đến hoạt động rnaase H.

· Hoạt động gia tăng của Tth-DNA polymerase (pH9, tối ưu +55℃～+70℃, tối đa +95℃) khắc phục các vấn đề do cấu trúc thứ cấp RNA gây ra.CDNA thu được có thể được khuếch đại bằng PCR với cùng loại enzyme đó với sự có mặt của ion Mg2+.

· Khả năng thực hiện phiên mã ngược và khuếch đại DNA ở nhiệt độ cao của Tth-DNA polymerase khiến enzyme này trở nên hữu ích cho RT-PCR định lượng, nhân bản và phân tích biểu hiện gen của RNA tế bào và virus.
· Tth-DNA polymerase được sử dụng cho RT-PCR để khuếch đại RNA lên đến 1kb.

Tính năng và ưu điểm

T DNA polymerase:

• Đảm bảo kích thước sản phẩm phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được tối ưu hóa, ít nhất 1000 bp trong phản ứng RT-PCR

• Chấp nhận deoxyribonucleoside triphosphate biến tính làm chất nền

• Không liên quan đến hoạt động của RNase H

• Có tính ổn định nhiệt cao để khắc phục các vấn đề thường liên quan đến cấu trúc bậc hai cao có trong RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymerase

DNA polymerase chịu nhiệt có hoạt tính phiên mã ngược

RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase là một enzyme chức năng kép, có khả năng chịu nhiệt cao, đã được thiết kế công nghệ với các hoạt động của enzyme phiên mã ngược và DNA polymerase thu được thông qua quá trình tiến hóa nhân tạo và có định hướng.

· Thời gian bán hủy của RevTaq RT-PCR DNA polymerase ở 95°C lớn hơn 40 phút.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase cho phép sao chép ngược ở nhiệt độ cao trực tiếp từ mẫu RNA và bước sao chép ngược có thể được lặp lại nhiều lần để tạo ra nhiều mẫu cDNA hơn.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase cho phép RT-PCR “zero-step” (không có bước sao chép ngược đẳng nhiệt), bởi vì trong bước mở rộng PCR theo chu kỳ, quá trình sao chép ngược và khuếch đại DNA xảy ra đồng thời.Điều này cũng thúc đẩy phản ứng phiên mã ngược ở nhiệt độ cao, do đó giảm thiểu các vấn đề gặp phải trong việc làm tan chảy cấu trúc bậc hai mạnh mẽ trong RNA ở nhiệt độ cao.

· Do công thức khởi động nóng dựa trên aptamer, RevTaq RT-PCR DNA polymerase sẽ cho kết quả tốt hơn khi nhiệt độ ủ và kéo dài cao hơn 57°C.

· Do enzym chịu nhiệt nên thiết kế mồi và mẫu dò có nhiệt độ nóng chảy rất cao (>60°C).

· Nên tối ưu hóa nhiệt độ của bước ủ/kéo dài thông qua gradient nhiệt độ trong quá trình thiết lập phản ứng.

· Nhiệt độ càng cao thì độ đặc hiệu của PCR càng cao.Chu trình phiên mã ngược thường được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn so với chu trình PCR, bởi vì phép lai DNA Primer:RNA Template thường có điểm nóng chảy cao hơn so với DNA Primer:cDNA Template duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase được biến đổi gen và tối ưu hóa, và kích thước bộ khuếch đại nằm trong khoảng 60-300 bp.

Giới hạn phát hiện DNA polymerase của RevTaq RT-PCR đạt 4 bản sao/

Hệ thống phản ứng được tối ưu hóa (thiết lập mồi có nhiệt độ nóng chảy cao) được thể hiện trong hình.RevTaq RT-PCR RT-PCR dựa trên DNA polymerase cho thấy độ nhạy tốt hơn so với hỗn hợp chính RT-qPCR 1 bước TaqPath và độ dốc pha loãng mẫu phát hiện thấp hơn.

Ưu điểm hơn:

Chức năng khởi động nhanh → Có thể bỏ qua bước biến tính nhiệt ban đầu.

Công thức aptamer khởi động nóng → Cung cấp 100% hoạt tính enzyme ngay lập tức và ngăn chặn sự khuếch đại không đặc hiệu ở nhiệt độ thấp (<57°C).

Chức năng phân tách → Bước tách chiết RNA được bỏ qua, vì RevTaq RT-PCR DNA polymerase cũng có thể xử lý các mẫu phản ứng thô.Nó có thể ngay lập tức phá hủy màng tế bào của sinh vật nhân chuẩn, vi khuẩn và vi rút trong một chu kỳ RT-PCR nóng.

Cấp nguyên liệu IVD → tiêu chuẩn chất lượng cao và giá cực kỳ cạnh tranh