1. Kiến thức cơ bản (các bạn muốn xem phần thực nghiệm vui lòng chuyển trực tiếp sang phần 2)

Là một phản ứng phái sinh của PCR thông thường, Real time PCR chủ yếu theo dõi sự thay đổi lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ của phản ứng khuếch đại PCR trong thời gian thực thông qua sự thay đổi của tín hiệu huỳnh quang và phân tích định lượng mẫu bắt đầu thông qua mối quan hệ giữa giá trị ct và đường cong chuẩn .

Dữ liệu cụ thể của RT-PCR làđường cơ sở, ngưỡng huỳnh quangVàgiá trị CT.

Các phương pháp dán nhãn phổ biến cho RT-PCR:

2. Các bước thí nghiệm

2.1 Về chia nhóm thực nghiệm- phải có nhiều giếng trong nhóm, và phải có sự lặp lại sinh học.

2.2 Nguyên tắc thiết kế mồi

①SiRNA đặc trưng cho loài và trình tự của các loài khác nhau sẽ khác nhau.

②SiRNA được đóng gói ở dạng bột đông khô, có thể bảo quản ổn định trong 2-4 tuần ở nhiệt độ phòng.

2.3 Dụng cụ hoặc thuốc thử cần chuẩn bị trước

2.4 Về các vấn đề cần lưu ý trong các bước thực nghiệm cụ thể:

①quá trình chuyển đổi siRNA

1. Để mạ, bạn có thể chọn đĩa 24 giếng, đĩa 12 giếng hoặc đĩa 6 giếng (nồng độ RNA trung bình được đề xuất trong mỗi giếng của đĩa 24 giếng là khoảng 100-300 ng/uL) và mật độ truyền máu tối ưu của các tế bào lên tới 60% -80% hoặc hơn

2. Các bước chuyển đổi và các yêu cầu cụ thể được thực hiện đúng theo hướng dẫn.

3. Sau khi truyền, các mẫu có thể được lấy trong vòng 24-72 giờ để phát hiện mRNA (RT-PCR) hoặc phát hiện protein trong vòng 48-96 giờ (WB)

② Quá trình chiết xuất RNA

1. Ngăn ngừa ô nhiễm bởi các enzym ngoại sinh.Nó chủ yếu bao gồm đeo khẩu trang và găng tay nghiêm ngặt;sử dụng đầu tip pipet và ống EP đã khử trùng;nước được sử dụng trong thí nghiệm phải không chứa RNase.

2. Nên thực hiện hai lần như đề xuất trong bộ chiết nhanh, điều này sẽ thực sự cải thiện độ tinh khiết và năng suất.

3. Chất lỏng thải không được chạm vào cột RNA.

③ Định lượng RNA

Sau khi RNA được chiết xuất, nó có thể được định lượng trực tiếp bằng Nanodrop và giá trị đọc tối thiểu có thể thấp tới 10ng/ul.

④Quá trình sao chép ngược

1. Do RT-qPCR có độ nhạy cao, nên tạo ít nhất 3 giếng song song cho mỗi mẫu để ngăn Ct tiếp theo quá khác biệt hoặc SD quá lớn để phân tích thống kê.

2. Không đóng băng và rã đông Master mix nhiều lần.

3. Mỗi ống/lỗ phải được thay thế bằng một đầu mới!Không liên tục sử dụng cùng một đầu pipet để thêm mẫu!

4. Màng dính vào đĩa 96 giếng sau khi thêm mẫu cần được làm phẳng bằng đĩa.Tốt nhất nên ly tâm trước khi đưa lên máy, để chất lỏng trên thành ống có thể chảy xuống và loại bỏ bọt khí.

⑤Phân tích đường cong chung

2.5 Về phân tích dữ liệu

Phân tích dữ liệu của qPCR có thể được chia thành định lượng tương đối và định lượng tuyệt đối.Ví dụ, các tế bào trong nhóm điều trị được so sánh với các tế bào trong nhóm đối chứng,

mARN của gen X thay đổi bao nhiêu lần, đây là định lượng tương đối;ở một số tế bào nhất định, mARN của gen X

Có bao nhiêu bản sao, đây là định lượng tuyệt đối.Thông thường những gì chúng ta sử dụng nhiều nhất trong phòng thí nghiệm là phương pháp định lượng tương đối.Thường xuyên,phương pháp 2-ΔΔctđược sử dụng nhiều nhất trong các thí nghiệm nên ở đây chỉ giới thiệu chi tiết phương pháp này.

Phương pháp 2-ΔΔct: Kết quả thu được là sự khác biệt về biểu hiện của gen mục tiêu ở nhóm thực nghiệm so với gen mục tiêu ở nhóm đối chứng.Yêu cầu hiệu suất khuếch đại của cả gen mục tiêu và gen tham chiếu bên trong phải gần 100% và độ lệch tương đối không được vượt quá 5%.

Phương pháp tính toán như sau:

Δct nhóm đối chứng = giá trị ct của gen mục tiêu trong nhóm đối chứng – giá trị ct của gen tham chiếu nội trong nhóm đối chứng

Δct nhóm thử nghiệm = giá trị ct của gen mục tiêu trong nhóm thử nghiệm – giá trị ct của gen tham chiếu bên trong nhóm thử nghiệm

ΔΔct=Δct nhóm thử nghiệm-Δct nhóm đối chứng

Cuối cùng, tính bội số của sự khác biệt ở cấp độ biểu thức:

Thay đổi Fold=2-ΔΔct (tương ứng với hàm excel là POWER)

Những sảm phẩm tương tự:

Bộ RT-qPCR trực tiếp cho tế bào