COVID-19 là một bệnh truyền nhiễm do vi-rút corona gây ra Hội chứng hô hấp cấp tính nặng Loại 2. Khi một người bị nhiễm bệnh, các triệu chứng phổ biến nhất bao gồm sốt, ho và khó thở.

Các mẫu được sử dụng để xét nghiệm có thể được thu thập bằng gạc mũi họng hoặc gạc hầu họng.

PCR là gì?

Phương pháp phát hiện coronavirus tiêu chuẩn là phản ứng chuỗi polymerase, PCR.Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử.Nó có thể nhanh chóng sao chép hàng triệu đến hàng tỷ đoạn DNA cụ thể.

Virus corona mới chứa bộ gen RNA sợi đơn rất dài.Để phát hiện những vi-rút này bằng PCR, các phân tử RNA phải được chuyển đổi thành trình tự DNA bổ sung của chúng bằng enzyme phiên mã ngược, sau đó DNA mới được tổng hợp có thể được khuếch đại bằng quy trình PCR tiêu chuẩn, thường được gọi là RT-PCR.

quy trình RT-PCR

chiết xuất RNA

Để thực hiện phương pháp này, về cơ bản RNA của virus cần được chiết xuất.Có thể sử dụng nhiều bộ kit tinh sạch RNA để phân tách thuận tiện, nhanh chóng và hiệu quả.

Để chiết xuất RNA của virus bằng bộ công cụ thương mại, trước tiên hãy thêm mẫu vào ống siêu ly tâm, sau đó trộn với dung dịch đệm ly giải.Bộ đệm này bị biến tính cao và thường bao gồm phenol và guanidine isothiocyanate.Ngoài ra, chất ức chế RNase thường có mặt trong dung dịch đệm ly giải để đảm bảo phân lập RNA virus nguyên vẹn.

Sau khi thêm dung dịch đệm ly giải, vortex ống trộn bằng xung và ủ ở nhiệt độ phòng.Virus sau đó được ly giải trong các điều kiện biến tính cao được cung cấp bởi bộ đệm ly giải.

Sau khi mẫu được ly giải, một ống ly tâm được sử dụng cho quy trình tinh chế.Mẫu được nạp vào ống ly tâm và sau đó ly tâm.

Quy trình này là một phương pháp chiết pha rắn trong đó pha tĩnh bao gồm một nền silica gel.

Trong điều kiện muối và pH tối ưu, các phân tử RNA liên kết với màng silica.

Đồng thời, protein và các chất gây ô nhiễm khác được loại bỏ.

Sau khi ly tâm, đặt ống ly tâm vào một ống thu gom sạch, loại bỏ dịch lọc, sau đó thêm đệm rửa.

Đặt ống vào máy ly tâm một lần nữa để đẩy dung dịch đệm rửa qua màng.Điều này sẽ loại bỏ tất cả các tạp chất còn lại khỏi màng, chỉ để lại RNA liên kết với silica gel.

Sau khi rửa mẫu, đặt ống vào ống ly tâm sạch và thêm dung dịch đệm rửa giải.

Sau đó, nó được ly tâm để đẩy dung dịch đệm rửa giải qua màng.Bộ đệm rửa giải loại bỏ RNA của virus khỏi cột quay và thu được RNA tinh khiết không chứa protein, chất ức chế và các chất gây ô nhiễm khác.

BƯỚC 2

thức ăn tinh hỗn hợp

Sau khi chiết xuất RNA virus, bước tiếp theo là chuẩn bị hỗn hợp phản ứng để khuếch đại PCR.Trong bước này, cô đặc được sử dụng.Dung dịch đậm đặc này là một dung dịch đậm đặc được trộn sẵn bao gồm hỗn hợp trộn sẵn, enzyme phiên mã ngược, nucleotide, mồi xuôi, mồi ngược, mẫu dò TaqMan và DNA polymerase.

Cuối cùng, để hoàn thành hỗn hợp phản ứng này, mẫu RNA được thêm vào.Các ống được trộn bằng xung vortexing, sau đó hỗn hợp phản ứng được nạp vào khay PCR.Đĩa PCR thường chứa 96 giếng và có thể phân tích nhiều mẫu cùng lúc.

BƯỚC 3

khuếch đại PCR

Tiếp theo, đặt đĩa vào máy PCR, về cơ bản là một máy luân nhiệt.

RT-PCR thời gian thực được sử dụng để phát hiện vi-rút corona mới 2019 bằng cách khuếch đại trình tự đích trong gen RdrRP, gen E và gen N.Việc lựa chọn gen mục tiêu phụ thuộc vào đoạn mồi và trình tự mẫu dò.

Bước đầu tiên của RT-PCR là phiên mã ngược.Chuỗi DNA bổ sung đầu tiên được tổng hợp, được bắt đầu bởi đoạn mồi ngược PCR, liên kết với phần bổ sung của bộ gen RNA virus.Sau đó, enzyme phiên mã ngược bổ sung các nucleotide DNA vào đầu 3′ của đoạn mồi để tổng hợp DNA bổ sung cho RNA của virus.Nhiệt độ và thời lượng của bước này phụ thuộc vào đoạn mồi, RNA đích và enzyme phiên mã ngược được sử dụng.

Tiếp theo, một bước biến tính ban đầu được áp dụng, dẫn đến sự biến tính của lai RNA-DNA.Bước này là cần thiết để kích hoạt DNA polymerase.Đồng thời, enzyme phiên mã ngược bị vô hiệu hóa.

PCR bao gồm một loạt các chu trình nhiệt.Mỗi chu kỳ bao gồm các bước biến tính, ủ và mở rộng.

Bước biến tính liên quan đến việc làm nóng buồng phản ứng đến 95 độ C và sử dụng nó để biến tính mẫu DNA sợi kép.

Trong bước tiếp theo, nhiệt độ phản ứng giảm xuống 58 độ C, cho phép đoạn mồi chuyển tiếp bám vào phần bổ sung của mẫu DNA sợi đơn của nó.Nhiệt độ ủ trực tiếp phụ thuộc vào độ dài và thành phần của mồi.

Trong bước mở rộng, DNA polymerase tổng hợp một chuỗi DNA mới bổ sung cho chuỗi mẫu DNA.Bằng cách thêm các hạt nhân tự do bổ sung vào khuôn mẫu theo hướng 5′ đến 3′ từ hỗn hợp phản ứng.Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào DNA polymerase được sử dụng.

Sau chu kỳ đầu tiên, mục tiêu DNA sợi kép thu được.

Sau đó, bước vào chu kỳ thứ hai.DNA sợi kép bị biến tính để tạo ra hai phân tử DNA sợi đơn.

Trong bước tiếp theo, nhiệt độ phản ứng được hạ xuống, các đoạn mồi được gắn vào từng mẫu DNA sợi đơn và đầu dò Taq-man được gắn vào phần bổ sung của DNA đích.

Đầu dò TaqMan bao gồm một huỳnh quang liên kết cộng hóa trị với đầu 5′ của đầu dò oligonucleotide.Khi bị kích thích bởi nguồn sáng của máy quay vòng, fluorophore phát ra huỳnh quang.Ngoài ra, đầu dò bao gồm một chất khử ở đầu 3′.Sự gần gũi của gen phóng viên với chất dập tắt ngăn cản việc phát hiện huỳnh quang.

Trong bước mở rộng, DNA polymerase tổng hợp một chuỗi mới.Khi polymerase đến đầu dò TaqMan, hoạt động 5′nuclease nội sinh của nó sẽ tách đầu dò, tách thuốc nhuộm ra khỏi chất khử.

Với mỗi chu kỳ PCR, nhiều phân tử thuốc nhuộm được giải phóng hơn, dẫn đến sự gia tăng cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bộ khuếch đại được tổng hợp.

Phương pháp này cho phép ước tính số lượng của một chuỗi nhất định có trong mẫu.Số lượng các đoạn ADN mạch kép tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ.Do đó, PCR có thể được sử dụng để phân tích các mẫu rất nhỏ.

Để đo tín hiệu huỳnh quang, đèn halogen vonfram, bộ lọc kích thích, gương phản xạ, thấu kính, bộ lọc phát xạ và camera CCD sử dụng thiết bị ghép nối điện tích.

BƯỚC 4 Phát hiện

Để đo tín hiệu huỳnh quang, đèn halogen vonfram, bộ lọc kích thích, gương phản xạ, thấu kính, bộ lọc phát xạ và camera CCD sử dụng thiết bị ghép nối điện tích.

Ánh sáng được lọc từ đèn được phản xạ bởi gương phản xạ, đi qua thấu kính hội tụ và được hội tụ vào tâm của mỗi lỗ.Sau đó, huỳnh quang phát ra từ lỗ được phản xạ từ gương, đi qua bộ lọc phát xạ và được camera CCD phát hiện.Trong mỗi chu kỳ PCR, ánh sáng huỳnh quang tự kích thích có thể được phát hiện bởi CCD.

Nó chuyển đổi ánh sáng thu được thành dữ liệu kỹ thuật số.Phương pháp này được gọi là PCR thời gian thực và nó cho phép theo dõi tiến trình của phản ứng PCR theo thời gian thực.