PCR (phản ứng chuỗi polymerase) là một trong những công nghệ khuếch đại DNA trong ống nghiệm, có lịch sử hơn 30 năm.

Công nghệ PCR được tiên phong bởi Kary Mullis của Cetus, Hoa Kỳ vào năm 1983. Mullis đã đăng ký bằng sáng chế PCR vào năm 1985 và xuất bản bài báo học thuật về PCR đầu tiên trên Science trong cùng năm đó.Mullis đã được trao giải Nobel hóa học năm 1993 cho công trình của mình.

Nguyên tắc cơ bản của PCR

PCR có thể khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu hơn một triệu lần.Nguyên tắc là dưới sự xúc tác của DNA polymerase, sử dụng DNA sợi gốc làm khuôn mẫu và đoạn mồi cụ thể làm điểm bắt đầu cho quá trình kéo dài.Nó được sao chép trong ống nghiệm thông qua các bước như biến tính, ủ và mở rộng.Quá trình DNA sợi con bổ sung cho DNA mẫu sợi mẹ.

Quy trình PCR tiêu chuẩn được chia thành ba bước:

1.Biến tính: Dùng nhiệt độ cao để tách sợi đôi DNA.Liên kết hydro giữa các sợi kép DNA bị phá vỡ ở nhiệt độ cao (93-98℃).

2. Ủ: Sau khi DNA sợi kép được tách ra, hạ nhiệt độ xuống để đoạn mồi có thể liên kết với DNA sợi đơn.

3. Sự mở rộng: DNA polymerase bắt đầu tổng hợp các sợi bổ sung dọc theo sợi DNA từ các đoạn mồi liên kết khi nhiệt độ hạ xuống.Khi quá trình kéo dài được hoàn thành, một chu kỳ được hoàn thành và số lượng các đoạn DNA tăng gấp đôi

Thực hiện qua lại ba bước này 25-35 lần, số lượng đoạn DNA sẽ tăng theo cấp số nhân.

Sự khéo léo của PCR là các đoạn mồi khác nhau có thể được thiết kế cho các gen mục tiêu khác nhau, do đó các đoạn gen mục tiêu có thể được khuếch đại trong một khoảng thời gian ngắn.

Cho đến nay, PCR có thể được chia thành ba loại, đó là PCR thông thường, PCR định lượng huỳnh quang và PCR kỹ thuật số.

Thế hệ đầu tiên của PCR thông thường

Sử dụng dụng cụ khuếch đại PCR thông thường để khuếch đại gen mục tiêu, sau đó sử dụng điện di trên gel agarose để phát hiện sản phẩm, chỉ có thể thực hiện phân tích định tính.

Nhược điểm chính của PCR thế hệ thứ nhất:

1. Dễ bị khuếch đại không đặc hiệu và kết quả dương tính giả.

2. Việc phát hiện mất nhiều thời gian và thao tác rườm rà.

3. Chỉ có thể thực hiện kiểm tra định tính

PCR thời gian thực thế hệ thứ hai

PCR thời gian thực, còn được gọi là qPCR, sử dụng các đầu dò huỳnh quang có thể chỉ ra tiến trình của hệ thống phản ứng và theo dõi sự tích lũy của các sản phẩm được khuếch đại thông qua sự tích lũy tín hiệu huỳnh quang và đánh giá kết quả thông qua đường cong huỳnh quang.Nó có thể được định lượng với sự trợ giúp của giá trị Cq và đường chuẩn.

Do công nghệ qPCR được thực hiện trong một hệ thống khép kín, khả năng nhiễm bẩn giảm và có thể theo dõi tín hiệu huỳnh quang để phát hiện định lượng nên nó được sử dụng rộng rãi nhất trong thực hành lâm sàng và trở thành công nghệ thống trị trong PCR.

Các chất huỳnh quang được sử dụng trong PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực có thể được chia thành: đầu dò huỳnh quang TaqMan, đèn hiệu phân tử và thuốc nhuộm huỳnh quang.

1) Đầu dò huỳnh quang TaqMan:

Trong quá trình khuếch đại PCR, một đầu dò huỳnh quang cụ thể được thêm vào trong khi thêm một cặp mồi.Đầu dò là một oligonucleotide và cả hai đầu được dán nhãn bằng nhóm huỳnh quang báo cáo và nhóm huỳnh quang dập tắt.

Khi đầu dò còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang do nhóm phóng viên phát ra sẽ được nhóm dập tắt hấp thụ;trong quá trình khuếch đại PCR, hoạt tính exonuclease 5′-3′ của enzyme Taq sẽ phân tách và làm suy giảm đầu dò, làm cho nhóm huỳnh quang báo cáo và chất khử Nhóm huỳnh quang được tách ra để hệ thống theo dõi huỳnh quang có thể nhận tín hiệu huỳnh quang, nghĩa là, mỗi khi một chuỗi DNA được khuếch đại, một phân tử huỳnh quang được hình thành và sự tích lũy tín hiệu huỳnh quang được đồng bộ hóa hoàn toàn với sự hình thành sản phẩm PCR.

2) Thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR:

Trong hệ thống phản ứng PCR, một lượng dư thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR được thêm vào.Sau khi thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR được tích hợp không đặc hiệu vào chuỗi kép DNA, nó sẽ phát ra tín hiệu huỳnh quang.Phân tử thuốc nhuộm SYBR không được tích hợp vào chuỗi sẽ không phát ra bất kỳ tín hiệu huỳnh quang nào, do đó đảm bảo tín hiệu huỳnh quang Sự gia tăng sản phẩm PCR hoàn toàn đồng bộ với sự gia tăng sản phẩm PCR.SYBR chỉ liên kết với DNA sợi kép, vì vậy đường cong nóng chảy có thể được sử dụng để xác định xem phản ứng PCR có đặc hiệu hay không.

3) Báo hiệu phân tử:

Nó là một đầu dò oligonucleotide được dán nhãn kép của vòng gốc tạo thành cấu trúc kẹp tóc gồm khoảng 8 base ở đầu 5 và 3.Các trình tự axit nucleic ở cả hai đầu được bắt cặp bổ sung, làm cho nhóm huỳnh quang và nhóm dập tắt trở nên chặt chẽ.Đóng lại, sẽ không có huỳnh quang được tạo ra.

Sau khi sản phẩm PCR được tạo ra, trong quá trình ủ, phần giữa của đèn hiệu phân tử được ghép nối với một chuỗi DNA cụ thể và gen huỳnh quang được tách ra khỏi gen dập tắt để tạo ra huỳnh quang.

Những nhược điểm chính của PCR thế hệ thứ hai:

Độ nhạy vẫn còn thiếu và việc phát hiện các mẫu vật có bản sao thấp là không chính xác.

Có ảnh hưởng của giá trị nền và kết quả dễ bị nhiễu.

Khi có chất ức chế PCR trong hệ thống phản ứng, kết quả phát hiện dễ bị nhiễu.

PCR kỹ thuật số thế hệ thứ ba

PCR kỹ thuật số (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) tính toán số lượng bản sao của trình tự đích thông qua phát hiện điểm cuối và có thể thực hiện phát hiện định lượng tuyệt đối chính xác mà không cần sử dụng các biện pháp kiểm soát nội bộ và đường cong tiêu chuẩn.

PCR kỹ thuật số sử dụng phương pháp phát hiện điểm cuối và không phụ thuộc vào giá trị Ct (ngưỡng chu kỳ), do đó phản ứng PCR kỹ thuật số ít bị ảnh hưởng bởi hiệu suất khuếch đại, khả năng chống lại các chất ức chế phản ứng PCR được cải thiện, với độ chính xác và khả năng tái tạo cao.

Do đặc điểm của độ nhạy cao và độ chính xác cao, nó không dễ bị can thiệp bởi các chất ức chế phản ứng PCR và nó có thể đạt được định lượng tuyệt đối thực sự mà không cần các sản phẩm tiêu chuẩn, đã trở thành điểm nóng nghiên cứu và ứng dụng.

Theo các hình thức khác nhau của đơn vị phản ứng, nó có thể được chia thành ba loại chính: hệ thống vi lỏng, chip và giọt.

1) PCR kỹ thuật số vi lỏng, mdPCR:

Dựa trên công nghệ vi lỏng, mẫu DNA được tách ra.Công nghệ vi lỏng có thể thực hiện việc nâng cấp nano mẫu hoặc tạo ra các giọt nhỏ hơn, nhưng các giọt này cần một phương pháp hấp phụ đặc biệt và sau đó kết hợp với hệ thống phản ứng PCR.mdPCR đã dần được các phương pháp khác thay thế.

2) PCR kỹ thuật số dựa trên giọt dịch, ddPCR:

Sử dụng công nghệ tạo giọt nước trong dầu để xử lý mẫu thành các giọt nhỏ và chia hệ thống phản ứng chứa các phân tử axit nucleic thành hàng nghìn giọt có kích thước nano, mỗi giọt không chứa phân tử đích axit nucleic cần phát hiện hoặc chứa một đến một số phân tử đích axit nucleic cần kiểm tra.

3) PCR kỹ thuật số dựa trên chip, cdPCR:

Sử dụng công nghệ đường dẫn chất lỏng tích hợp để khắc nhiều vi ống và lỗ siêu nhỏ trên tấm silicon hoặc thủy tinh thạch anh, đồng thời kiểm soát dòng chảy của dung dịch thông qua các van điều khiển khác nhau và chia chất lỏng mẫu thành các nanomet có cùng kích thước vào các giếng phản ứng cho Phản ứng PCR kỹ thuật số để đạt được định lượng tuyệt đối.

Nhược điểm chính của PCR thế hệ thứ ba:

Các thiết bị và thuốc thử đắt tiền.

Các yêu cầu chất lượng mẫu là cao.Nếu số lượng mẫu vượt quá số lượng của hệ thống vi mô, thì sẽ không thể định lượng được và nếu quá nhỏ, độ chính xác của việc định lượng sẽ giảm.

Dương tính giả cũng có thể được tạo ra khi có sự khuếch đại không đặc hiệu.