PCR, nhiều PCR, PCR tại chỗ, PCR đảo ngược, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Chúng tôi sẽ phân loại các khái niệm, các bước và chi tiết của PCR khác nhau

Ⅰ. PCR

Phản ứng chuỗi polymerase, được gọi là PCR, là một công nghệ sinh học phân tử được sử dụng để phóng to các đoạn DNA cụ thể.Nó có thể được coi là một sự sao chép DNA đặc biệt trong ống nghiệm.DNA polymerase (DNA Polymerase I) được phát hiện sớm nhất vào năm 1955, và Đoạn Klenow của E. Coli, có giá trị thực nghiệm và thực tiễn, được Tiến sĩ H. Klenow phát hiện vào đầu những năm 1970, nhưng do enzyme này không chịu được nhiệt độ, nhiệt độ cao có thể làm thoái hóa nó nên không đáp ứng được phản ứng chuỗi polymerase thoái hóa ở nhiệt độ cao.Các enzyme được sử dụng ngày nay (được gọi là Taq polymerase), được phân lập từ Thermus Aquaus, một loại vi khuẩn suối nước nóng vào năm 1976. Đặc điểm của nó là có thể chịu được nhiệt độ cao và là một loại enzyme lý tưởng, nhưng nó được sử dụng rộng rãi sau những năm 1980.Khái niệm ban đầu về nguyên mẫu ban đầu ban đầu của PCR tương tự như sửa chữa và sao chép gen đã được đề xuất bởi Tiến sĩ KJell Kleppe vào năm 1971. Ông đã công bố bản sao gen ngắn hạn và đơn giản đầu tiên (tương tự như hai phản ứng chu kỳ đầu tiên của PCR).PCR được phát triển ngày nay do Tiến sĩ Kary B. Mullis phát triển vào năm 1983. Tiến sĩ Mullis đã phục vụ các công ty PE vào năm đó, vì vậy PE có một vị trí đặc biệt trong ngành PCR.Tiến sĩ Mullis đã chính thức xuất bản bài báo liên quan đầu tiên với Saiki và những người khác vào năm 1985. Kể từ đó, việc sử dụng PCR là hàng nghìn dặm một ngày và chất lượng của các bài báo liên quan có thể nói là khiến nhiều phương pháp nghiên cứu khác không hài lòng.Sau đó, kỹ thuật PCR được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu khoa học sinh học và ứng dụng lâm sàng, trở thành công nghệ quan trọng nhất của nghiên cứu sinh học phân tử.Mullis cũng đoạt giải Nobel Hóa học năm 1993.

PCRNguyên tắc

Nguyên tắc cơ bản của công nghệ PCR tương tự như quá trình sao chép tự nhiên của DNA và tính đặc hiệu của nó phụ thuộc vào đoạn mồi oligonucleotide bổ sung cho cả hai đầu của trình tự đích.PCR bao gồm ba bước phản ứng cơ bản gồm thoái hóa-ủ-kéo dài: ①Phân hủy DNA mẫu: Sau khi DNA mẫu được làm nóng đến khoảng 93°C trong một khoảng thời gian nhất định, dung dịch DNA kép cho DNA chuỗi kép được hình thành nhờ quá trình khuếch đại PCR của DNA mẫu Rời đi, biến nó thành một chuỗi đơn để có thể kết hợp với mồi để chuẩn bị cho phản ứng vòng tiếp theo.②Ủ (hợp chất) của DNA mẫu và mồi: Sau khi DNA mẫu được làm nóng và thoái hóa thành một chuỗi đơn, nhiệt độ giảm xuống khoảng 55°C.Trình tự bổ sung của đoạn mồi và chuỗi đơn DNA mẫu.③Phần mở rộng của đoạn mồi: Mẫu DNA-sự liên kết của đoạn mồi dựa trên hoạt động của TaqDNA polymerase, với dNTP là nguyên liệu thô của phản ứng.Giữ nguyên nguyên tắc sao chép, tổng hợp chuỗi sao chép bán dành riêng mới bổ sung cho chuỗi DNA mẫu và lặp lại ba quá trình thoái hóa-ủ-mở rộng chu kỳ có thể nhận được nhiều “chuỗi sao chép bán dành riêng” hơn và chuỗi mới này lại có sẵn Trở thành khuôn mẫu cho chu kỳ tiếp theo.Mất 2-4 phút để hoàn thành vòng lặp, gen mục tiêu có thể được khuếch đại vài triệu lần trong 2-3 giờ.

Tiêu chuẩnPCRhệ thống phản ứng

Năm yếu tố của phản ứng PCR

Chủ yếu có 5 loại chất tham gia vào phản ứng PCR, đó là primer, enzyme, dNTP, template và buffer (Mg2+ là bắt buộc).[Quy trình PCR]

Quy trình PCR tiêu chuẩn được chia thành ba bước

1. Thoái hóa DNA (90°C-96°C): Khuôn mẫu DNA chuỗi kép dưới tác động nhiệt, liên kết hydro bị phá vỡ, tạo thành DNA chuỗi đơn.

2. Ủ (25℃ -65℃): Nhiệt độ hệ thống giảm xuống, đoạn mồi được kết hợp với mẫu DNA để tạo thành chuỗi kép cục bộ.

3. Kéo dài (70℃ -75℃): Dưới tác dụng của enzyme Taq (khoảng 72°C, hoạt tính tốt nhất), dNTP được sử dụng làm nguyên liệu thô, kéo dài từ đầu 5′ của primer → đầu 3′, tổng hợp và khuôn mẫu bổ sung cho nhau trong chuỗi DNA.

Mỗi chu kỳ được biến tính, ủ và kéo dài, tăng gấp đôi hàm lượng DNA.Hiện tại, do vùng khuếch đại ngắn, một số PCR có thể được sao chép trong thời gian rất ngắn ngay cả khi hoạt tính của enzyme Taq không tối ưu, do đó có thể thay đổi thành hai bước, tức là có thể thực hiện ủ và kéo dài ở 60°C-65°C cùng một lúc.Nhằm giảm quá trình nâng hạ và làm mát và cải thiện tốc độ đáp ứng.

Tính năng phản ứng PCR

● Độ đặc hiệu cao

Các yếu tố quyết định cụ thể của phản ứng PCR là: ①Sự kết hợp cụ thể giữa mồi và DNA mẫu.②Nguyên tắc ghép nối cơ sở.③Sự trung thành của phản ứng tổng hợp TaqDNA polymerase.④Tính đặc hiệu và tính bảo thủ của gen mục tiêu.

Sự kết hợp chính xác của mồi và mẫu là chìa khóa.Sự liên kết của mồi với khuôn và sự kéo dài của chuỗi mồi dựa trên nguyên tắc kết hợp bazơ kiềm.Sự trung thành của các phản ứng tổng hợp polymerase và khả năng chịu nhiệt độ cao của Taq DNA polymerase để tạo liên kết (hợp chất) của khuôn mẫu và mồi trong phản ứng có thể được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.Tính đặc hiệu của sự kết hợp được tăng lên rất nhiều.Clip có thể duy trì mức độ chính xác cao.Bằng cách chọn một vùng di truyền mục tiêu có tính bảo tồn cao và tính bảo thủ cao, tính đặc hiệu của nó cao hơn.

● Độ nhạy cao

Khối lượng tạo sản phẩm PCR được tăng theo chỉ số, có thể mở rộng khuôn mẫu ban đầu của Picker (PG=10-12) để tăng mức vi điều khiển lên mức microgam (μg= -6).Một ô mục tiêu có thể được phát hiện từ 1 triệu ô;trong việc phát hiện virus, độ nhạy của PCR có thể đạt tới 3 RFU (đơn vị hình thành điểm trống);tỷ lệ phát hiện tối thiểu trong khoa học vi khuẩn là 3 vi khuẩn.

● Đơn giản và nhanh chóng

Phản xạ PCR sử dụng Taq DNA polymerase ở nhiệt độ cao, bổ sung dung dịch phản ứng cùng một lúc, tức là phản ứng thoái hóa-ủ-mở rộng trên dung dịch khuếch đại DNA và nồi cách thủy.Nói chung, phản ứng khuếch đại được hoàn thành trong 2 đến 4 giờ.Các sản phẩm tăng cường thường được phân tích bằng kiếm điện và không phải sử dụng đồng vị, không gây ô nhiễm phóng xạ và quảng cáo dễ dàng.

● Độ tinh khiết của mẫu vật thấp

Không cần phải tách virus hoặc vi khuẩn và tế bào nuôi cấy.Các sản phẩm thô DNA và RNA có thể được sử dụng làm bộ khuếch đại.Phát hiện khuếch đại DNA có thể được sử dụng trực tiếp bằng cách sử dụng các mẫu bệnh phẩm như máu, dịch cơ thể, nước rửa mũi khi ho, tóc, tế bào và mô sống.

PCRnhững vấn đề chung

● Âm tính giả, không có dải khuếch đại

Các giai đoạn chính của phản ứng PCR bao gồm: ① chuẩn bị axit nucleic mẫu, ② chất lượng và độ đặc hiệu của mồi, ③ chất lượng của enzyme ④ Điều kiện chu trình PCR.Việc tìm ra nguyên nhân cũng cần được phân tích và nghiên cứu cho các liên kết trên.

Tiêu bản: ① Tiêu bản chứa protein linh tinh, ② Tiêu bản chứa chất ức chế enzym Taq, ③ Protein trong tiêu bản không bị đào thải, đặc biệt là protein nhóm trong nhiễm sắc thể.⑤ Sự thoái hóa axit nucleic deminer không triệt để.Khi chất lượng enzyme và mồi tốt, không có dải khuếch đại, rất có thể đó là quá trình xử lý tiêu hóa bệnh phẩm.Đã xảy ra sự cố với quy trình chiết xuất axit nucleic của mẫu, vì vậy để chuẩn bị dung dịch phân hủy hiệu quả và ổn định, quy trình của nó phải được cố định và không được tự ý thay đổi.

Bất hoạt enzyme: nên sử dụng cùng lúc một loại enzyme mới hoặc cả enzyme cũ và mới để phân tích xem hoạt tính của enzyme có bị mất hay không đủ dẫn đến âm tính giả.Cần lưu ý rằng enzyme Taq hoặc ethidium bromide đôi khi bị lãng quên.

Lớp sơn lót: chất lượng của lớp sơn lót, nồng độ của lớp sơn lót và nồng độ của hai lớp sơn lót có đối xứng hay không.Đó là một lý do phổ biến khiến PCR thất bại hoặc dải tăng không lý tưởng và dễ bị khuếch tán.Có vấn đề với chất lượng mồi của một số lô.Hai mồi có nồng độ cao và nồng độ thấp, gây ra sự khuếch đại không đối xứng hiệu quả thấp.Các biện pháp đối phó là: ① Chọn một đoạn mồi tốt để tổng hợp các đơn vị.② Nồng độ của mồi không chỉ phụ thuộc vào giá trị OD mà còn chú ý đến chất lỏng ban đầu của mồi để tạo điện di gel đường agar.Phải có vùng dải mồi và độ sáng của hai lớp sơn lót nói chung phải nhất quán.Belt, PCR có thể thất bại vào lúc này, và nó cần được giải quyết bằng bộ phận tổng hợp mồi.Nếu mồi cao, độ sáng thấp và nồng độ của nó phải được cân bằng khi pha loãng.③ Lớp sơn lót nên được thanh toán và bảo quản ở nồng độ cao tránh để các bộ phận tủ lạnh bị đóng băng nhiều lần hoặc làm lạnh lâu ngày sẽ khiến lớp sơn lót bị biến chất và biến chất.④ Thiết kế của mồi không hợp lý, chẳng hạn như độ dài của mồi không đủ và cụm di được hình thành giữa các mồi.

Nồng độ Mg2+: Nồng độ ion Mg2+ có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất khuếch đại PCR.Nồng độ quá cao có thể làm giảm sự khuếch đại ngược giới tính PCR.Nếu nồng độ quá thấp, đầu ra khuếch đại PCR thậm chí sẽ làm cho quá trình khuếch đại PCR không thành công nếu không có dải mở rộng.

Thay đổi thể tích phản ứng: Thể tích dùng trong khuếch đại PCR là 20ul, 30ul và 50ul hoặc 100uL, thể tích lớn nhỏ ứng dụng cho khuếch đại PCR được đặt theo mục đích nghiên cứu khoa học và thử nghiệm lâm sàng khác nhau.Sau khi làm các thể tích nhỏ như 20ul thì khi làm size phải có điều kiện buộc dây, nếu không sẽ hỏng.

Lý do vật lý: Biến đổi là rất quan trọng đối với khuếch đại PCR.Nếu nhiệt độ thoái hóa thấp, thời gian thoái hóa ngắn, dễ xảy ra âm tính giả;nhiệt độ ủ quá thấp có thể gây ra hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu và làm giảm hiệu quả khuếch đại đặc hiệu.Ảnh hưởng nhiều đến sự kết hợp giữa primer và template làm giảm hiệu quả khuếch đại PCR.Đôi khi cần phải sử dụng nhiệt kế tiêu chuẩn để phát hiện sự biến đổi, nhiệt độ ủ và nhiệt độ mở rộng trong nồi mở rộng hoặc nồi hòa tan trong nước, đây là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự thất bại của PCR.

Các biến thể của trình tự đích: Nếu trình tự đích xảy ra, đột biến hoặc xóa, sự kết hợp giữa nguyên mẫu và mẫu được kết hợp hoặc do thiếu trình tự đích, mồi và mẫu sẽ mất trình tự bổ sung và quá trình khuếch đại PCR của nó sẽ không thành công.

● Dương tính giả

Dải khuếch đại PCR xuất hiện phù hợp với dải trình tự mục tiêu và đôi khi dải của nó gọn gàng hơn và cao hơn.

Thiết kế mồi chưa phù hợp: trình tự khuếch đại được chọn và trình tự khuếch đại phi mục đích có sự tương đồng nên khi PCR khuếch đại sản phẩm PCR khuếch đại là trình tự phi mục đích.Trình tự mục tiêu quá ngắn hoặc đoạn mồi quá ngắn và dễ bị dương tính giả.Cần phải được thiết kế lại.

Ô nhiễm chéo của trình tự mục tiêu hoặc các sản phẩm khuếch đại: Có hai lý do cho sự ô nhiễm này: Thứ nhất, ô nhiễm chéo của toàn bộ bộ gen hoặc các phân đoạn lớn, dẫn đến dương tính giả.Loại dương tính giả này có thể được giải quyết bằng các phương pháp sau: Cẩn thận và nhẹ nhàng trong quá trình vận hành để tránh chuỗi mục tiêu hít vào súng mẫu hoặc văng ra khỏi ống ly tâm.Ngoại trừ enzym và các chất không chịu được nhiệt độ cao, tất cả các thuốc thử hoặc thiết bị nên được khử trùng bằng áp suất cao.Các ống và mẫu ly tâm nên được sử dụng cùng một lúc.Khi cần thiết, trước khi thêm mẫu vật, ống phản ứng và thuốc thử được chiếu tia cực tím để phá hủy axit nucleic hiện có.Thứ hai, mảnh vỡ nhỏ trong ô nhiễm không khí.Những đoạn nhỏ này ngắn hơn trình tự đích, nhưng chúng có tính tương đồng nhất định.Nó có thể được nối với nhau.Sau khi bổ sung mồi, sản phẩm PCR có thể được mở rộng, điều này sẽ gây ra hiện tượng dương tính giả.Nó có thể được sử dụng để giảm hoặc loại bỏ phương pháp PCR tổ.

● Xuất hiện dải khuếch đại không đặc hiệu

Các dải xuất hiện sau quá trình khuếch đại PCR không phù hợp với kích thước dự kiến, hoặc lớn hoặc nhỏ, hoặc đồng thời hoặc không đồng thời, các dải khuếch đại đặc hiệu và dải khuếch đại không đặc hiệu.Sự xuất hiện của các dải không đặc hiệu là: Thứ nhất, các đoạn mồi bổ sung không hoàn toàn cho trình tự mục tiêu hoặc sự trùng hợp của đoạn mồi để tạo thành một cụm di.Thứ hai là nồng độ ion MG2+ quá cao, nhiệt độ ủ quá thấp và số chu kỳ PCR có liên quan.Thứ hai, chất lượng và số lượng enzyme.Thường thì enzym của một số nguồn dễ xảy ra các băng không đặc biệt còn enzym của nguồn kia thì không xảy ra.Đôi khi cũng xảy ra hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu của enzym.Các biện pháp đối phó là: thiết kế lại sức hấp dẫn nếu cần thiết.Giảm lượng enzyme hoặc thay thế enzyme của nguồn khác.Giảm số lượng chính, tăng số lượng mẫu một cách thích hợp và giảm số lượng chu kỳ.Tăng nhiệt độ ủ một cách hợp lý hoặc sử dụng phương pháp hai điểm nhiệt độ (thoái hóa 93°C, ủ và kéo dài ở khoảng 65°C).

● Xuất hiện băng keo bong tróc hoặc vết bẩn

Khuếch đại PCR đôi khi dường như được áp dụng hoặc có vỏ hoặc đai giống như thảm.Nguyên nhân là do lượng enzyme quá nhiều hoặc chất lượng enzyme kém, nồng độ dNTP quá cao, nồng độ Mg2+ quá cao, nhiệt độ ủ quá thấp và số chu kỳ quá nhiều.Các biện pháp đối phó là: ①Giảm lượng enzyme hoặc thay đổi nguồn enzyme khác.②Giảm nồng độ dNTP ③Giảm nồng độ Mg2+ một cách hợp lý.④Tăng số lượng mẫu và giảm số chu kỳ.

Những sảm phẩm tương tự

PCR Heroᵀᴹ (Có thuốc nhuộm)

◮ Độ trung thực cao hơn: gấp 6 lần so với enzyme Taq thông thường;

◮ Tốc độ khuếch đại nhanh hơn

◮ Khả năng thích ứng mẫu nhiều hơn

◮ Hiệu suất khuếch đại cao hơn

◮ Khả năng chịu đựng môi trường mạnh hơn: đặt ở 37°C trong một tuần, duy trì hơn 90% hoạt động;

◮ Nó có hoạt tính 5'→3' DNA polymerase và 5'→3' exonuclease, không có hoạt tính 3'→5' exonuclease.

PCR Easyᵀᴹ (Có thuốc nhuộm)

Hệ thống phản ứng độc đáo và Taq DNA Polymerase hiệu quả cao làm cho phản ứng PCR có hiệu suất khuếch đại, độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Một bước)-SYBR Green I

◮ Bộ công cụ một bước thực hiện hai phản ứng sao chép ngược và qPCR trong cùng một ống, chỉ cần thêm RNA mẫu, đoạn mồi PCR cụ thể và ddH không chứa RNase₂O.

◮ Bộ kit này có thể phân tích định lượng RNA của virus hoặc theo dõi RNA một cách nhanh chóng và hiệu quả.

◮ Bộ kit sử dụng thuốc thử phiên mã ngược Foregene độc ​​đáo và Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kết hợp với hệ thống phản ứng độc đáo để cải thiện hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu của phản ứng.

◮ Hệ thống phản ứng được tối ưu hóa giúp phản ứng có độ nhạy phát hiện cao hơn, ổn định nhiệt mạnh hơn và khả năng chịu đựng tốt hơn.

◮ RT-qPCR dễ dàng^TM(One Step)-SYBR Green I kit đi kèm với thuốc nhuộm tham chiếu bên trong ROX, có thể được sử dụng để loại bỏ nền tín hiệu và lỗi tín hiệu giữa các giếng, thuận tiện cho khách hàng sử dụng trong các mẫu thiết bị PCR định lượng khác nhau.

RT dễ dàng^TMII (Trộn tổng thể cho tổng hợp cDNA sợi đầu tiên choPCR thời gian thực)

-Khả năng loại bỏ gDNA hiệu quả, có thể loại bỏ gDNA trong tiêu bản trong vòng 2 phút.

-Hệ thống phiên mã ngược hiệu quả, chỉ mất 15 phút để hoàn thành quá trình tổng hợp chuỗi cDNA đầu tiên.

-Các mẫu phức tạp: các mẫu có hàm lượng GC cao và cấu trúc thứ cấp phức tạp cũng có thể được đảo ngược với hiệu quả cao.

-Hệ thống phiên mã ngược có độ nhạy cao, các mẫu cấp độ pg cũng có thể nhận được cDNA chất lượng cao.

-Hệ thống phiên mã ngược có độ ổn định nhiệt cao, nhiệt độ phản ứng tối ưu là 42℃, ở 50℃ vẫn cho hiệu suất sao chép ngược tốt.