Theo tôi, một số phát minh mang tính cách mạng trong lịch sử công nghệ phát hiện là công nghệ dán nhãn miễn dịch dựa trên nguyên tắc liên kết đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể, công nghệ PCR và công nghệ giải trình tự.Hôm nay chúng ta sẽ nói về công nghệ PCR.Theo sự phát triển của công nghệ PCR, người ta thường chia công nghệ PCR thành ba thế hệ: công nghệ PCR thông thường, công nghệ PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực và công nghệ PCR kỹ thuật số.
Ckỹ thuật ommon PCR
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis đã phát minh ra phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction, PCR) vào năm 1983. Người ta kể rằng khi đang lái xe cho bạn gái, anh chợt có cảm hứng và nghĩ ra nguyên lý của PCR (về lợi ích của việc lái xe).Kary Mullis đã được trao giải Nobel Hóa học năm 1993. Thời báo New York nhận xét: "Rất độc đáo và có ý nghĩa, gần như chia sinh học thành thời kỳ tiền PCR và hậu PCR.
Nguyên tắc của PCR: Dưới sự xúc tác của DNA polymerase, DNA sợi mẹ được sử dụng làm khuôn mẫu và đoạn mồi cụ thể được sử dụng làm điểm bắt đầu kéo dài và DNA sợi con bổ sung cho DNA mẫu sợi mẹ được sao chép trong ống nghiệm thông qua quá trình biến tính, ủ, kéo dài và các bước khác.Đây là công nghệ khuếch đại tổng hợp DNA trong ống nghiệm, có thể khuếch đại nhanh chóng và đặc hiệu bất kỳ DNA mục tiêu nào trong ống nghiệm.
Ưu điểm của PCR thông thường
1.Phương pháp cổ điển, đầy đủ các tiêu chuẩn quốc tế và trong nước
2.Chi phí thuốc thử dụng cụ thấp hơn
3.Sản phẩm PCR có thể được phục hồi cho các thí nghiệm sinh học phân tử khác
Máy PCR Foregene khuyên dùng: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Sản phẩm liên quan: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Nhược điểm của PCR thông thường
1.dễ gây ô nhiễm
2.thao tác rườm rà
3.chỉ phân tích định tính
4.Độ nhạy vừa phải
5.Có sự khuếch đại không đặc hiệu và khi dải không đặc hiệu có cùng kích thước với dải mục tiêu thì không thể phân biệt được
CPCR dựa trên điện di mao mạch
Để đối phó với những thiếu sót của PCR thông thường, một số nhà sản xuất đã giới thiệu các công cụ dựa trên nguyên tắc điện di mao quản.Bước điện di sau khi khuếch đại PCR được hoàn thành trong mao quản.Độ nhạy cao hơn và có thể phân biệt được sự khác biệt của một số cơ sở và có thể tính toán độ khuếch đại bằng MAERKER.nội dung sản phẩm.Nhược điểm là sản phẩm PCR vẫn cần được mở ra và đưa vào thiết bị, và vẫn có nguy cơ nhiễm bẩn cao.
Cmao mạchEđiện di
2. Công nghệ PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực (Quantitative Real-time PCR, qPCR)PCR định lượng huỳnh quang, còn được gọi là PCR thời gian thực, là một công nghệ định lượng axit nucleic mới do PE (Perkin Elmer) phát triển vào năm 1995. Lịch sử phát triển của PCR định lượng huỳnh quang là lịch sử đấu tranh chấn động tâm hồn của những người khổng lồ như ABI, Roche và Bio-Rad.Nếu bạn quan tâm, bạn có thể kiểm tra nó.Kỹ thuật này hiện là kỹ thuật PCR bán định lượng hoàn thiện nhất và được sử dụng rộng rãi.
Máy qPCR được đề xuất:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Phương pháp nhuộm huỳnh quang (SYBR Green I):SYBR Green I là thuốc nhuộm gắn DNA được sử dụng phổ biến nhất cho PCR định lượng, thuốc nhuộm này gắn không đặc hiệu với DNA sợi kép.Ở trạng thái tự do, SYBR Green phát ra huỳnh quang yếu, nhưng khi đã liên kết với DNA sợi đôi, huỳnh quang của nó tăng gấp 1000 lần.Do đó, tổng tín hiệu huỳnh quang phát ra từ một phản ứng tỷ lệ thuận với lượng DNA sợi kép hiện có và sẽ tăng lên cùng với sự gia tăng của sản phẩm khuếch đại.Vì thuốc nhuộm liên kết không đặc hiệu với DNA sợi kép nên có thể tạo ra kết quả dương tính giả.
Các sản phẩm liên quan: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Phương pháp đầu dò huỳnh quang (công nghệ Taqman): Trong quá trìnhKhuếch đại PCR, một đầu dò huỳnh quang cụ thể được thêm vào cùng lúc với một cặp mồi.Đầu dò là một oligonucleotide tuyến tính, với nhóm báo cáo huỳnh quang và nhóm dập tắt huỳnh quang tương ứng được dán nhãn ở cả hai đầu.Khi đầu dò còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang do nhóm phóng viên phát ra sẽ được nhóm khử chất hấp thụ và phát hiện Không có tín hiệu huỳnh quang;trong quá trình khuếch đại PCR (trong giai đoạn mở rộng), hoạt tính 5'-3' Dicer của enzyme Taq sẽ tiêu hóa và làm suy giảm đầu dò, do đó nhóm huỳnh quang báo cáo và nhóm huỳnh quang dập tắt được tách ra, để hệ thống giám sát huỳnh quang có thể nhận được tín hiệu huỳnh quang, nghĩa là mỗi khi chuỗi DNA được khuếch đại, một phân tử huỳnh quang được hình thành, thực hiện đồng bộ hóa hoàn toàn sự tích lũy tín hiệu huỳnh quang và sự hình thành các sản phẩm PCR.Phương pháp thăm dò Taqman là phương pháp phát hiện được sử dụng phổ biến nhất trong phát hiện lâm sàng.
Sản phẩm liên quan: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Ưu điểm của qPCR
1.Phương pháp đã hoàn thiện và thiết bị hỗ trợ và thuốc thử đã hoàn tất
2.Chi phí thuốc thử trung bình
3.dễ sử dụng
4.Độ nhạy và độ đặc hiệu phát hiện cao
Nhược điểm của qPCR
Đột biến của gen mục tiêu dẫn đến phát hiện bị bỏ lỡ.
Không thể xác định kết quả phát hiện của mẫu có nồng độ thấp.
Có một sai số lớn khi sử dụng đường chuẩn để phát hiện định lượng.
3. Công nghệ PCR kỹ thuật số (digital PCR, dPCR)
PCR kỹ thuật số là kỹ thuật định lượng tuyệt đối các phân tử axit nucleic.So với qPCR, PCR kỹ thuật số có thể đọc trực tiếp số lượng phân tử DNA/RNA, đây là phép định lượng tuyệt đối của các phân tử axit nucleic trong mẫu ban đầu.Năm 1999, Bert Vogelstein và Kenneth W. Kin-zler chính thức đề xuất khái niệm dPCR.
Năm 2006, Fluidigm là công ty đầu tiên sản xuất thiết bị dPCR dựa trên chip thương mại.Năm 2009, Life Technologies ra mắt hệ thống OpenArray và QuantStudio 12K Flex dPCR.Vào năm 2013, Life Technologies đã ra mắt hệ thống QuantStudio 3DdPCR, sử dụng công nghệ chip vi lỏng có kích thước nano mật độ cao để phân phối đồng đều các mẫu cho 20.000 tế bào riêng lẻ.trong phản ứng tốt.
Vào năm 2011, Bio-Rad đã ra mắt thiết bị QX100 dPCR dựa trên giọt nhỏ, sử dụng công nghệ nước trong dầu để phân phối đều mẫu cho 20.000 giọt nước trong dầu và sử dụng máy phân tích giọt để phân tích các giọt.Vào năm 2012, RainDance đã ra mắt thiết bị RainDrop dPCR, chạy bằng khí áp suất cao, để chia mỗi hệ thống phản ứng tiêu chuẩn thành một nhũ tương phản ứng chứa các giọt siêu nhỏ ở mức 1 triệu đến 10 triệu picoliter.
Cho đến nay, PCR kỹ thuật số đã hình thành hai phe chính, loại chip và loại giọt.Bất kể loại PCR kỹ thuật số nào, các nguyên tắc cốt lõi của nó là hạn chế pha loãng, PCR điểm cuối và phân phối Poisson.Hệ thống phản ứng PCR tiêu chuẩn có chứa các mẫu axit nucleic được chia đều thành hàng chục nghìn phản ứng PCR, được phân phối cho các chip hoặc microdroplet, sao cho mỗi phản ứng chứa càng nhiều phân tử mẫu càng tốt và phản ứng PCR mẫu đơn phân tử được thực hiện.Bằng cách đọc huỳnh quang, sự hiện diện hay vắng mặt của tín hiệu được tính và định lượng tuyệt đối được thực hiện sau khi hiệu chỉnh phân bố Poisson thống kê.
Sau đây là các đặc điểm của một số nền tảng PCR kỹ thuật số mà tôi đã sử dụng:
1. PCR kỹ thuật số dạng giọt Bio-Rad QX200 Bio-RadQX200 là một nền tảng PCR kỹ thuật số rất cổ điển, quy trình phát hiện cơ bản: 20.000 mẫu được tạo ra bởi bộ tạo giọt nước Các vi giọt nước trong dầu được khuếch đại trên máy PCR thông thường và cuối cùng tín hiệu huỳnh quang của từng vi giọt được đọc bởi một đầu đọc vi giọt.Hoạt động phức tạp hơn và nguy cơ ô nhiễm là trung bình.
Xinyi TD1 micro-droplet PCR kỹ thuật sốXinyi TD1 là một nền tảng PCR kỹ thuật số trong nước, quy trình phát hiện cơ bản: tạo ra 30.000-50.000 giọt nước trong dầu thông qua bộ tạo giọt, khuếch đại trên thiết bị PCR thông thường và cuối cùng chuyển qua đầu đọc giọt đọc tín hiệu huỳnh quang của từng giọt.Cả quá trình tạo và đọc giọt dịch trong nền tảng này đều được thực hiện trong một con chip chuyên dụng có nguy cơ nhiễm bẩn thấp.
PCR kỹ thuật số vi giọt chip STILLA NaicaSTILLA Naica là một nền tảng PCR kỹ thuật số tương đối mới.Quy trình phát hiện cơ bản là: thêm dung dịch phản ứng vào chip, đưa chip vào hệ thống khuếch đại và tạo giọt siêu nhỏ, đồng thời tạo ra 30.000 giọt siêu nhỏ.Trải rộng trên chip và quá trình khuếch đại PCR được hoàn thành trên chip.Sau đó, chip khuếch đại được chuyển đến hệ thống phân tích đọc vi giọt nước và tín hiệu huỳnh quang được đọc bằng cách chụp ảnh.Vì toàn bộ quá trình diễn ra trong một con chip khép kín nên nguy cơ nhiễm bẩn thấp.
4. PCR kỹ thuật số chip 3D ThermoFisher QuantStudio
ThermoFisher QuantStudio 3D là một nền tảng PCR kỹ thuật số dựa trên chip cổ điển khác.Quy trình phát hiện cơ bản của nó là: thêm dung dịch phản ứng vào bộ rải và trải đều dung dịch phản ứng lên chip với 20.000 microwell thông qua bộ rải., đưa chip lên máy PCR để khuếch đại, cuối cùng đưa chip vào đầu đọc và chụp ảnh để đọc tín hiệu huỳnh quang.Hoạt động tương đối phức tạp và toàn bộ quá trình được thực hiện trong một con chip kín và nguy cơ nhiễm bẩn thấp.
5. PCR kỹ thuật số chip JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity là một nền tảng PCR kỹ thuật số loại chip tương đối mới.Quy trình phát hiện cơ bản của nó là: thêm dung dịch phản ứng vào đầu bôi và trải đều dung dịch phản ứng lên 10.000 ống PCR được cố định trong ống PCR thông qua đầu bôi.Trên chip vi xốp, dung dịch phản ứng đi vào chip thông qua hoạt động mao dẫn và ống PCR có chip được đặt trên máy PCR để khuếch đại, cuối cùng chip được đưa vào đầu đọc để đọc tín hiệu huỳnh quang bằng cách chụp ảnh.Các hoạt động là phức tạp hơn.Nguy cơ ô nhiễm thấp.
Các thông số của từng nền tảng PCR kỹ thuật số được tóm tắt như sau:
Các chỉ số đánh giá của nền tảng PCR kỹ thuật số là: số lượng đơn vị phân chia, số lượng kênh huỳnh quang, mức độ phức tạp khi vận hành và nguy cơ nhiễm bẩn.Nhưng điều quan trọng nhất là độ chính xác phát hiện.Một cách để đánh giá các nền tảng PCR kỹ thuật số là sử dụng nhiều nền tảng PCR kỹ thuật số để xác minh lẫn nhau và một cách khác là sử dụng các chất chuẩn có giá trị chính xác.
Ưu điểm của dPCR
1.Đạt được định lượng tuyệt đối
2.Độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn
3.Có thể phát hiện các mẫu sao chép thấp
Nhược điểm của dPCR1. Thiết bị và thuốc thử đắt tiền 2. Thao tác phức tạp và thời gian phát hiện lâu 3. Phạm vi phát hiện hẹp
Hiện tại, ba thế hệ công nghệ PCR đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng, mỗi thế hệ đều có lĩnh vực ứng dụng riêng, không phải thế hệ này thay thế thế hệ kia là mối quan hệ.Sự tiến bộ không ngừng của công nghệ đã mang lại sức sống mới cho công nghệ PCR, cho phép nó mở ra hết hướng ứng dụng này đến hướng ứng dụng khác, giúp việc phát hiện axit nucleic thuận tiện và chính xác hơn.
Nguồn: Tiến sĩ Yuan đưa bạn đi xét nghiệm
Sản phẩm khuyến cáo:
Thời gian đăng bài: 18-Nov-2022
