PCR là công nghệ khuếch đại axit nucleic được sử dụng rộng rãi nhất và được sử dụng rộng rãi do độ nhạy và độ đặc hiệu của nó.Tuy nhiên, PCR yêu cầu biến tính nhiệt lặp đi lặp lại và không thể thoát khỏi những hạn chế phụ thuộc vào dụng cụ và thiết bị, điều này hạn chế ứng dụng của nó trong thử nghiệm lâm sàng.

Từ đầu những năm 1990, nhiều phòng thí nghiệm đã bắt đầu phát triển công nghệ khuếch đại nhiệt độ không đổi không yêu cầu biến tính nhiệt.Giờ đây, họ đã phát triển công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp, công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt thay thế sợi, công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt vòng tròn lăn và sự phụ thuộc trình tự axit nucleic.công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt và các công nghệ khác. 

Lkhuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian oop

Nguyên tắc khuếch đại dựa trên thực tế là DNA ở trạng thái cân bằng động ở khoảng 65°C.Khi bất kỳ đoạn mồi nào được bắt cặp cơ sở và kéo dài đến phần bổ sung của DNA sợi kép, sợi kia sẽ phân tách và trở thành sợi đơn.

Ở nhiệt độ này, DNA sử dụng 4 đoạn mồi đặc hiệu để nhờ vào enzyme DNA polymerase thay thế sợi để thực hiện quá trình tổng hợp DNA thay thế sợi tự diễn ra liên tục.

Đầu tiên xác định 6 vùng đặc hiệu F3, F2, F1, B1, B2, B3 trên gen mục tiêu, sau đó thiết kế 4 đoạn mồi dựa trên 6 vùng đặc hiệu này (như trong hình bên dưới):

Lớp sơn lót phía trước bên trong (FIP) bao gồm F1c và F2.

Lớp sơn lót phía sau bên trong (BIP) bao gồm B1c và B2, và TTTT được sử dụng như một miếng đệm ở giữa.

Các mồi ngoài F3 và B3 lần lượt bao gồm các vùng F3 và B3 trên gen mục tiêu.

Trong hệ thống phản ứng LAMP, nồng độ của lớp sơn lót bên trong gấp nhiều lần so với lớp sơn lót bên ngoài.Đầu tiên, đoạn mồi bên trong được kết hợp với chuỗi mẫu để tổng hợp chuỗi bổ sung để tạo thành chuỗi kép DNA.Sau đó, đoạn mồi bên ngoài được kết hợp với chuỗi mẫu để tạo thành chuỗi kép DNA.Dưới tác dụng của BstDNA polymerase, chuỗi bổ sung được tổng hợp bởi đoạn mồi bên trong được giải phóng.Sau một loạt phản ứng, chuỗi bổ sung cuối cùng tạo thành một chuỗi DNA đơn có cấu trúc quả tạ.

Bản thân sợi đơn DNA cấu trúc quả tạ được sử dụng làm khuôn mẫu để liên tục tạo thành DNA cấu trúc vòng lặp gốc chuyển tiếp với một đầu mở.Các đoạn mồi bên trong và bên ngoài hướng dẫn DNA cấu trúc vòng gốc chuyển tiếp liên tục trải qua các phản ứng dịch chuyển và kéo dài sợi, và cuối cùng hình thành nhiều cấu trúc vòng gốc với độ dài khác nhau.hỗn hợp ADN.

Ưu điểm và nhược điểm của khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp

Ưu điểm của ĐÈN:

(1) Hiệu quả khuếch đại cao, có thể khuếch đại hiệu quả 1-10 bản sao của gen mục tiêu trong vòng 1 giờ và hiệu suất khuếch đại gấp 10-100 lần so với PCR thông thường.

(2) Thời gian phản ứng ngắn, độ đặc hiệu cao và không cần thiết bị đặc biệt.

Những thiếu sót của LAMP:

(1) Yêu cầu đối với sơn lót đặc biệt cao.

(2) Sản phẩm được khuếch đại không thể được sử dụng để nhân bản và giải trình tự, mà chỉ có thể được sử dụng để phán đoán.

(3) Do độ nhạy mạnh nên dễ hình thành sol khí, gây dương tính giả và ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.

Skhuếch đại dịch chuyển trand

Khuếch đại dịch chuyển sợi (SDA) là một kỹ thuật khuếch đại DNA đẳng nhiệt trong ống nghiệm dựa trên phản ứng enzym do học giả người Mỹ Walker đề xuất lần đầu tiên vào năm 1992.

Hệ thống cơ bản của SDA bao gồm một endonuclease hạn chế, một DNA polymerase với hoạt động dịch chuyển sợi, hai cặp mồi, dNTP, và các ion canxi và magiê và hệ thống đệm.

Nguyên tắc khuếch đại dịch chuyển sợi dựa trên trình tự nhận biết endonuclease hạn chế đã được sửa đổi về mặt hóa học ở cả hai đầu của DNA đích.Endonuclease mở ra khoảng trống trong chuỗi DNA tại vị trí nhận biết của nó và DNA polymerase mở rộng khoảng cách 3′ Kết thúc và thay thế chuỗi DNA tiếp theo.

Các sợi đơn DNA được thay thế có thể được kết hợp với mồi và kéo dài thành sợi đôi nhờ DNA polymerase.Quá trình này được lặp lại liên tục để trình tự mục tiêu được khuếch đại một cách hiệu quả.

Ưu điểm và nhược điểm của công nghệ khuếch đại dịch chuyển sợi

Ưu điểm của SDA:

Hiệu suất khuếch đại cao, thời gian phản ứng ngắn, độ đặc hiệu mạnh và không cần thiết bị đặc biệt.

Những thiếu sót của SDA:

Các sản phẩm không đồng nhất và một số sản phẩm sợi đơn và sợi đôi luôn được sản xuất trong chu trình SDA và chắc chắn sẽ xảy ra hiện tượng bám đuôi khi được phát hiện bằng điện di.

Rkhuếch đại vòng tròn olling

Khuếch đại vòng tròn lăn (RCA) được đề xuất dựa trên phương pháp sao chép DNA từ các sinh vật gây bệnh bằng vòng tròn lăn.Nó đề cập đến việc sử dụng DNA vòng tròn đơn sợi làm khuôn ở nhiệt độ không đổi và DNA polymerase đặc biệt (chẳng hạn như Phi29) ) Dưới tác động của quá trình tổng hợp DNA vòng tròn để đạt được sự khuếch đại của gen mục tiêu.

RCA có thể được chia thành khuếch đại tuyến tính và khuếch đại hàm mũ.Hiệu quả của RCA tuyến tính có thể đạt tới 10⁵lần và hiệu quả của RCA theo cấp số nhân có thể đạt tới 10⁹lần.

Phân biệt đơn giản như hình bên dưới, khuếch đại tuyến tính a chỉ sử dụng 1 mồi, khuếch đại hàm mũ b có 2 mồi.

RCA tuyến tính còn được gọi là RCA mồi đơn.Một đoạn mồi liên kết với DNA vòng và được mở rộng nhờ hoạt động của DNA polymerase.Sản phẩm này là một sợi đơn tuyến tính với số lượng lớn các trình tự lặp đi lặp lại gấp hàng nghìn lần độ dài của một vòng đơn.

Vì sản phẩm của RCA tuyến tính luôn được kết nối với mồi bắt đầu, nên việc cố định tín hiệu dễ dàng là một lợi thế lớn.

RCA theo cấp số nhân, còn được gọi là HRCA khuếch đại siêu phân nhánh (RCA siêu phân nhánh), trong RCA theo cấp số nhân, một đoạn mồi khuếch đại sản phẩm RCA, đoạn mồi thứ hai lai với sản phẩm RCA và mở rộng, và phần thay thế đã được liên kết với sản phẩm RCA.

Ưu điểm và nhược điểm của khuếch đại axit nucleic vòng tròn lăn

Ưu điểm của RCA:

Độ nhạy cao, độ đặc hiệu tốt và hoạt động dễ dàng.

Những thiếu sót của RCA:

Vấn đề nền trong quá trình phát hiện tín hiệu.Trong phản ứng RCA, đầu dò ổ khóa không tuần hoàn và DNA hoặc RNA mẫu của đầu dò không liên kết có thể tạo ra một số tín hiệu nền. 

Nkhuếch đại dựa trên trình tự axit nucleic

Khuếch đại dựa trên trình tự axit nucleic (NASBA) là một công nghệ mới được phát triển trên cơ sở PCR.Đó là quá trình khuếch đại axit nucleic liên tục và đẳng nhiệt được hướng dẫn bởi một cặp mồi có trình tự khởi đầu T7.Công nghệ này có thể khuếch đại RNA khuôn mẫu khoảng 109 lần trong khoảng 2 giờ, gấp 1000 lần so với phương pháp PCR thông thường và không cần thiết bị đặc biệt.

Công nghệ này đã được sử dụng để chẩn đoán nhanh các bệnh ngay khi nó xuất hiện và nhiều công ty hiện đang sử dụng phương pháp này trong các bộ phát hiện RNA.

Mặc dù quá trình khuếch đại RNA cũng có thể sử dụng công nghệ PCR phiên mã ngược, nhưng NASBA có những ưu điểm riêng: nó có thể được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ tương đối ổn định, ổn định và chính xác hơn công nghệ PCR truyền thống.

Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ 41 độ C và cần có men sao chép ngược AMV (vi-rút myeloblastosis ở gia cầm), RNase H, T7 RNA polymerase và một cặp mồi để hoàn thành.

Quá trình chủ yếu bao gồm:

Đoạn mồi phía trước chứa trình tự bổ sung của trình khởi động T7.Trong quá trình phản ứng, đoạn mồi chuyển tiếp liên kết với sợi RNA và được xúc tác bởi enzyme AMV để tạo thành sợi kép DNA-RNA.

RNase H tiêu hóa RNA trong sợi kép lai và giữ lại DNA sợi đơn.

Dưới tác dụng của đoạn mồi ngược và enzym AMV, một sợi kép ADN chứa trình tự khởi động T7 được hình thành.

Dưới tác dụng của T7 RNA polymerase, quá trình phiên mã được hoàn thành và một lượng lớn RNA đích được tạo ra.

Ưu điểm của NASBA:

(1) Đoạn mồi của nó có trình tự khởi động T7, nhưng DNA sợi kép ngoại lai không có trình tự khởi động T7 và không thể khuếch đại, vì vậy công nghệ này có độ đặc hiệu và độ nhạy cao.

(2) NASBA đưa trực tiếp quá trình phiên mã ngược vào phản ứng khuếch đại, rút ​​ngắn thời gian phản ứng.

Nhược điểm của NASBA:

(1) Các thành phần phản ứng phức tạp hơn.

(2) Cần có ba loại enzim để làm cho chi phí phản ứng cao hơn.