Giá trị Ct là hình thức trình bày kết quả quan trọng nhất của PCR định lượng huỳnh quang.Nó được sử dụng để tính toán sự khác biệt về biểu hiện gen hoặc số lượng bản sao gen.Vậy giá trị Ct của định lượng huỳnh quang như thế nào được coi là hợp lý?Làm thế nào để đảm bảo phạm vi hiệu quả của giá trị Ct?

Giá trị Ct là gì?
Trong quá trình khuếch đại qPCR, số chu kỳ khuếch đại (Cycle Threshold) tương ứng khi tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm khuếch đại đạt đến ngưỡng huỳnh quang đã đặt.C là viết tắt của Chu kỳ và T là viết tắt của Ngưỡng.Nói một cách đơn giản, giá trị Ct là số chu kỳ tương ứng với thời điểm khuếch đại mẫu ban đầu đạt đến một lượng sản phẩm nhất định trong qPCR.Cái gọi là “một lượng sản phẩm nhất định” sẽ được giải thích thêm sau.

Giá trị Ct làm gì?

1. Mối quan hệ giữa khuếch đại hàm mũ, lượng mẫu và giá trị Ct
Lý tưởng nhất là các gen trong qPCR được tích lũy bằng cách khuếch đại theo cấp số nhân sau một số chu kỳ nhất định.Mối quan hệ giữa số chu kỳ khuếch đại và số lượng sản phẩm là: Số lượng sản phẩm được khuếch đại = số lượng mẫu ban đầu × (1+En) số chu kỳ.Tuy nhiên, phản ứng qPCR không phải lúc nào cũng ở tình trạng lý tưởng.Khi lượng sản phẩm khuếch đại đạt đến “lượng sản phẩm nhất định”, số chu kỳ lúc này chính là giá trị Ct và nó đang trong giai đoạn khuếch đại hàm mũ.Mối quan hệ giữa giá trị Ct và số lượng bản sao bắt đầu: Có một mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị Ct của bản mẫu và logarit của số lượng bản sao bắt đầu của bản mẫu.Nồng độ mẫu ban đầu càng cao, giá trị Ct càng nhỏ;nồng độ mẫu ban đầu càng thấp, giá trị Ct càng lớn.

2. Đường cong khuếch đại, ngưỡng huỳnh quang và lượng sản phẩm PCR nhất định
Lượng sản phẩm khuếch đại qPCR được trình bày trực tiếp dưới dạng tín hiệu huỳnh quang, tức là đường cong khuếch đại.Trong giai đoạn đầu của PCR, quá trình khuếch đại ở điều kiện lý tưởng, số chu kỳ nhỏ, sản phẩm tích lũy nhỏ và mức độ huỳnh quang không thể phân biệt rõ ràng với nền huỳnh quang.Sau đó, huỳnh quang tăng lên và bước vào giai đoạn lũy thừa.Lượng sản phẩm PCR có thể được phát hiện tại một thời điểm nhất định khi phản ứng PCR chỉ ở giai đoạn lũy thừa, có thể được sử dụng làm “một lượng sản phẩm nhất định” và từ đó có thể suy ra hàm lượng ban đầu của mẫu.Do đó, cường độ tín hiệu huỳnh quang tương ứng với một lượng sản phẩm nhất định là ngưỡng huỳnh quang.

Ở giai đoạn cuối của PCR, đường cong khuếch đại không còn hiển thị khuếch đại hàm mũ nữa và chuyển sang pha tuyến tính và pha cao nguyên.

3. Khả năng lặp lại giá trị Ct
Khi chu kỳ PCR đạt đến số chu kỳ của giá trị Ct, nó mới bước vào giai đoạn khuếch đại hàm mũ thực sự.Tại thời điểm này, lỗi nhỏ chưa được khuếch đại, do đó khả năng tái tạo giá trị Ct là tuyệt vời, nghĩa là cùng một mẫu được khuếch đại ở các thời điểm khác nhau hoặc trong các ống khác nhau cùng một lúc.Khuếch đại, giá trị Ct thu được là không đổi.

1. Hiệu quả khuếch đại En
Hiệu suất khuếch đại PCR đề cập đến hiệu quả mà polymerase chuyển đổi gen được khuếch đại thành một bộ khuếch đại.Hiệu suất khuếch đại khi biến nạp 1 phân tử ADN thành 2 phân tử ADN là 100%.Hiệu suất khuếch đại thường được biểu thị bằng En.Để thuận tiện cho việc phân tích các bài viết tiếp theo, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất khuếch đại được giới thiệu ngắn gọn.

2.Phạm vi giá trị Ct
Giá trị Ct dao động từ 15-35.Nếu giá trị Ct nhỏ hơn 15 thì coi như độ khuếch đại nằm trong khoảng của chu kỳ nền và chưa đạt ngưỡng huỳnh quang.Lý tưởng nhất là có một mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị Ct và logarit của số bản sao ban đầu của mẫu, tức là đường cong chuẩn.Thông qua đường cong chuẩn, khi hiệu suất khuếch đại là 100%, giá trị Ct tính toán để định lượng số bản sao đơn lẻ của gen là khoảng 35. Nếu lớn hơn 35 thì số bản sao ban đầu của khuôn mẫu về lý thuyết nhỏ hơn 1, có thể coi là vô nghĩa.

Đối với các khoảng Ct gen khác nhau, do số lượng bản sao gen và hiệu suất khuếch đại của lượng khuôn ban đầu có sự khác nhau nên cần phải lập đường cong chuẩn cho gen và tính khoảng phát hiện tuyến tính của gen.

3.Các yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Ct
Từ mối quan hệ giữa số chu kỳ khuếch đại và lượng sản phẩm: lượng sản phẩm khuếch đại = lượng mẫu ban đầu × (1 + En) số chu kỳ, có thể thấy rằng trong điều kiện lý tưởng, lượng mẫu ban đầu và En sẽ có tác động tiêu cực đến giá trị Ct bị ảnh hưởng.Sự khác biệt về chất lượng mẫu hoặc hiệu suất khuếch đại sẽ khiến giá trị Ct quá lớn hoặc quá nhỏ.

4. Giá trị Ct quá lớn hoặc quá nhỏ