PCR trực tiếp là phản ứng sử dụng trực tiếp các mô động vật hoặc thực vật để khuếch đại mà không cần chiết xuất axit nucleic.Theo nhiều cách, PCR trực tiếp hoạt động giống như PCR thông thường

Sự khác biệt chính là bộ đệm tùy chỉnh được sử dụng trong PCR trực tiếp, mẫu có thể được trực tiếp đưa vào phản ứng PCR mà không cần chiết xuất axit nucleic, nhưng có các yêu cầu tương ứng về khả năng chịu đựng của enzyme và khả năng tương thích của bộ đệm liên quan đến phản ứng PCR trực tiếp.

Mặc dù trong các mẫu thông thường có ít nhiều chất ức chế phản ứng PCR, PCR trực tiếp vẫn có thể đạt được độ khuếch đại đáng tin cậy dưới tác dụng của enzyme và chất đệm.Phản ứng PCR truyền thống yêu cầu axit nucleic chất lượng cao làm khuôn, có thể cản trở tiến trình thuận lợi của phản ứng PCR nếu khuôn chứa protein và các tạp chất khác.PCR trực tiếp hiện là một trong những công nghệ phổ biến hơn trong lĩnh vực chẩn đoán phân tử.

01 Direct PCR ban đầu được sử dụng cho động vật và thực vật

Ứng dụng sớm nhất của PCR trực tiếp là trong lĩnh vực động vật và thực vật, chẳng hạn như máu, mô và lông của chuột, mèo, gà, thỏ, cừu, gia súc, v.v., lá và hạt của cây, v.v., được sử dụng để nghiên cứu kiểu gen, chuyển gen, phát hiện plasmid, phân tích loại bỏ gen, xác định nguồn DNA, xác định loài, phân tích SNP và các lĩnh vực khác.

Những lĩnh vực này có một số đặc điểm chung, đó là hàm lượng gen mục tiêu tương đối cao và quá trình chiết xuất axit nucleic rất rắc rối, do đó PCR trực tiếp không chỉ tiết kiệm thời gian và tác động nhỏ đến kết quả mà còn tiết kiệm chi phí.

PCR trực tiếp được sử dụng để phát hiện mầm bệnh là vấn đề của những năm gần đây, một số nhà sản xuất thuốc thử PCR đã có nhiều nỗ lực theo hướng này khi thực hiện đổi mới.Đặc biệt trong đợt dịch COVID-19 này, nhiều sản phẩm phát hiện như vậy đã xuất hiện trên thị trường, chẳng hạn như Bộ dụng cụ phát hiện axit nucleic SARS-CoV-2 (Phương pháp thăm dò huỳnh quang Multiplex PCR) do Foregene nghiên cứu và phát triển, sử dụng công nghệ Real-time RT PCR (rRT-PCR) để phát hiện định tính axit nucleic của SARS-CoV-2 trong các mẫu bệnh phẩm phết mũi họng hoặc hầu họng của con người.

Foregene là một trong những công ty sử dụng công nghệ PCR trực tiếp để phát hiện ORF1ab, N, E vàkhác nhau dòng axit nucleic trong các mẫu tăm bông ở mũi họng hoặc hầu họng của con người như dòng SARS-CoV-2 B.1.1.7 (Anh), dòng B.1.351 (ZA), dòng B.1.617 (IND) và dòng P.1 (BR).

02  Thuốc thử cần thiết cho PCR trực tiếp

Ly giải mẫu

Lysate mẫu có thể được cấu hình bởi chính bạn hoặc mua.Sự khác biệt về thành phần của các nhãn hiệu lysate khác nhau sẽ làm cho khả năng ly giải khác nhau, và sau đó thời gian ly giải sẽ hơi khác nhau.Ví dụ, để chuẩn bị các mẫu mô động vật, thường nên ly giải trong 30 phút hoặc qua đêm và dung dịch ly giải đối với vi-rút nằm trong khoảng từ 3-10 phút.

Hỗn hợp tổng thể PCR

Nên sử dụng DNA polymerase khởi động nóng để tăng cường khuếch đại đặc hiệu và tăng khả năng khuếch đại.Cốt lõi của PCR trực tiếp là một polymerase có khả năng chịu đựng cao.

Loại bỏ hoặc ức chế các thành phần trong mẫu ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại DNA

Sau khi mẫu được xử lý với dịch ly giải, protein, lipid và các mảnh vỡ tế bào khác sẽ được giải phóng, những chất này sẽ ức chế phản ứng PCR.Do đó, PCR trực tiếp yêu cầu bổ sung chất loại bỏ hoặc chất ức chế tương ứng để giảm ảnh hưởng của các yếu tố này.

03  Bộ sưu tập năm điểm kiến ​​thức về PCR trực tiếp

Đầu tiên, công nghệ Direct PCR là công nghệ PCR trực tiếp các mẫu sinh phẩm khác nhau.Trong điều kiện kỹ thuật này, không cần phải tách và chiết xuất axit nucleic, trực tiếp sử dụng mẫu mô làm đối tượng và thêm mồi gen mục tiêu là để thực hiện phản ứng PCR.

Thứ hai, công nghệ PCR trực tiếp không chỉ là công nghệ khuếch đại khuôn mẫu DNA truyền thống mà còn bao gồm PCR phiên mã ngược khuôn mẫu RNA.

Thứ ba, công nghệ Direct PCR không chỉ trực tiếp thực hiện các phản ứng PCR định tính thông thường trên các mẫu mô mà còn bao gồm các phản ứng Real-Time qPCR, đòi hỏi hệ thống phản ứng phải có khả năng can thiệp huỳnh quang chống nền mạnh và huỳnh quang nội sinh dập tắt khả năng đối kháng.

Thứ tư, các mẫu được nhắm mục tiêu bởi công nghệ PCR trực tiếp chỉ cần giải phóng các mẫu axit nucleic và không loại bỏ protein, polysacarit, ion muối, v.v. gây cản trở phản ứng PCR.Điều này đòi hỏi axit nucleic polymerase và PCR Mix trong hệ thống phản ứng phải có sức đề kháng và khả năng thích ứng tuyệt vời để đảm bảo hoạt động của enzyme và độ chính xác của quá trình sao chép trong các điều kiện phức tạp.

Thứ năm, mẫu mô được nhắm mục tiêu bởi công nghệ PCR trực tiếp mà không cần xử lý làm giàu axit nucleic và lượng mẫu rất nhỏ, đòi hỏi hệ thống phản ứng phải có độ nhạy và hiệu suất khuếch đại cực cao.