Tôi tin rằng mọi người sẽ luôn gặp phải những vấn đề như vậy khi thực hiện phản ứng PCR, nhưng hầu hết chúng có thể được phân thành hai vấn đề chính:

Quá ít khuếch đại mẫu gen (khuếch đại);
Quá nhiều khuếch đại gen không mục tiêu.
Sử dụng phụ gia là một trong những chiến lược phổ biến để giải quyết những vấn đề này.Thông thường vai trò của phụ gia có hai khía cạnh:
cấu trúc thứ cấpcủa gen (cấu trúc thứ cấp);
Giảm mồi không đặc hiệu.
Hôm nay biên tập viên sẽ giới thiệu sơ lược đến các bạn các chất phụ gia thường gặp trong phản ứng PCR và chức năng của chúng.
Phụ gia làm giảm cấu trúc thứ cấp
sulfoxit(DMSO)
mẫu genvới hàm lượng GC cao.Tuy nhiên, DMSO cũng làm giảm đáng kể hoạt động của Taq polymerase.Do đó, mọi người phải cân bằng khả năng tiếp cận tiêu bản và hoạt động của polymerase.Người biên tập gợi ý rằng bạn có thể thử các nồng độ khác nhau của DSMO, chẳng hạn như từ 2% đến 10%, để tìm ra nồng độ phù hợp với thí nghiệm của mình.
Chất tẩy rửa không ion
Các chất tẩy rửa không ion, chẳng hạn như 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 hoặc NP-40, thường làm giảm cấu trúc bậc hai của DNA.Mặc dù điều này có thể làm tăng khả năng khuếch đại của gen mẫu, nhưng nó cũng sẽ gây ra sự cố khuếch đại không đặc hiệu.Vì vậy, các chất phụ gia này hoạt động tốt đối với các phản ứng PCR năng suất thấp không có mảnh vụn, nhưng không hiệu quả đối với các phản ứng PRC tương đối không tinh khiết.Một lợi ích khác của chất tẩy rửa không ion là giảm ô nhiễm SDS.Thông thường trong quá trình tách chiết DNA, SDS sẽ được đưa đến bước PCR, điều này sẽ ức chế rất nhiều hoạt động của polymerase.Do đó, thêm 0,5% Tween-20 hoặc Tween-40 vào phản ứng có thể vô hiệu hóa các tác động tiêu cực của SDS.
betaine_
Betaine có thể cải thiện quá trình khuếch đại DNA bằng cách giảm sự hình thành cấu trúc thứ cấp và nói chung là một bổ sung “bí ẩn” cho các bộ PCR thương mại.Nếu bạn muốn sử dụng betaine, bạn nên cho betaine hoặc betaine mono-hydrat (Betaine hoặc Betaine mono-hydrate), chứ không phải betaine hydrochloride (Betaine HCl), điều chỉnh đến nồng độ cuối cùng là 1-1,7M.Betaine cũng có thể giúp cải thiện tính đặc hiệu vì nó loại bỏ sự phụ thuộc vào thành phần cặp bazơ của sự tan chảy DNA/sự biến tính DNA.
Phụ gia để giảm sơn lót không đặc hiệu
formamid
Formamide là một chất phụ gia PCR hữu cơ thường được sử dụng.Nó có thể kết hợp với rãnh chính và rãnh phụ trong DNA, do đó làm giảm tính ổn định của chuỗi xoắn kép DNA chính và hạ thấp nhiệt độ nóng chảy của DNA.Nồng độ của formamid được sử dụng trong các thí nghiệm PCR thường là 1% -5%.
Tetrametylamoni clorua( TMAC)
Tetramethylammonium chloride có thể làm tăng tính đặc hiệu lai hóa (hybridization specificity) và tăng nhiệt độ nóng chảy của DNA.Do đó, TMAC có thể loại bỏ mồi không đặc hiệu và giảm sự gắn nhầm DNA và RNA.Nếu bạn dùngthoái hóa mồitrong phản ứng PCR nhớ thêm TMAC thường dùng với nồng độ 15-100mM.
Các chất phụ gia phổ biến khác
Ngoài 2 loại phụ gia nêu trên còn có nhiều loại phụ gia phổ biến trong phản ứng PCR, tuy có chức năng khác nhau nhưng chúng cũng rất quan trọng.
ion magie
Ion magie là đồng yếu tố không thể thiếu (cofactor) của polymerase, nghĩa là không có ion magie thì polymerase không hoạt động.Tuy nhiên, quá nhiều ion magie cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của polymerase.Nồng độ của các ion magie trong mỗi phản ứng PCR sẽ khác nhau.Các tác nhân tạo phức (như EDTA hoặc citrate), nồng độ của dNTP và protein đều ảnh hưởng đến nồng độ của các ion magie.Vì vậy, nếu bạn gặp vấn đề với thí nghiệm PCR của mình, bạn có thể thử thay đổi các nồng độ ion magie khác nhau, ví dụ: từ 1,0 thành 4,0mM, với khoảng cách giữa các khoảng từ 0,5–1mM.
Điều đáng chú ý là nhiều chu kỳ đóng băng-tan băng có thể dẫn đến sự phân tầng nồng độ của dung dịch magie clorua .Do đó, bạn phải hòa tan hoàn toàn trước mỗi lần sử dụng và trộn đều trước khi sử dụng.
albumin huyết thanh bò(Albumin bò, BSA)
Trong các thí nghiệm hóa học phân tử, albumin huyết thanh bò là một chất phụ gia rất phổ biến, đặc biệt là trong các thí nghiệm PCR và tiêu hóa enzyme hạn chế.Trong các phản ứng PCR, BSA rất hữu ích trong việc giảm các chất gây ô nhiễm như các hợp chất phenolic.Và người ta cũng nói rằng nó có thể làm giảm độ bám dính của các chất phản ứng với thành ống nghiệm.Trong phản ứng PCR, thông thường nồng độ BSA cho vào có thể đạt tới 0,8 mg/ml.
 
Những sảm phẩm tương tự:
anh hùng PCR(có thuốc nhuộm)
anh hùng PCR