Xác minh hiệu suất của mồi và mẫu dò trong giai đoạn đầu của thuốc thử PCR và xác định điều kiện phản ứng phù hợp nhất là điều kiện tiên quyết để đảm bảo tiến trình suôn sẻ của các thí nghiệm chính thức.
Vì vậy, làm thế nào để chúng ta cần xác nhận thăm dò mồi trong giai đoạn đầu?
Các chỉ số chính là đường cơ sở, đường cong khuếch đại, giá trị ct, hiệu suất khuếch đại, phát hiện mẫu có nồng độ thấp, CV, v.v.
đường cơ sở
Đường cơ sở là đường nằm ngang trong đường cong khuếch đại PCR.Trong vài chu kỳ đầu tiên của phản ứng khuếch đại PCR, tín hiệu huỳnh quang không thay đổi nhiều và tạo thành một đường thẳng.Đường thẳng này là đường cơ sở.
Khi sàng lọc các mẫu dò mồi PCR, hãy chú ý xem đường cơ sở có bằng nhau hay không.Độ tinh khiết của nồng độ đầu dò mồi sẽ ảnh hưởng đến đường nền, chẳng hạn như làm cho đường nền tăng hoặc giảm.Đường cơ sở cũng là một chỉ số rất trực quan.
Đường cong khuếch đại
Một chỉ báo trực quan khác là hình dạng của đường cong khuếch đại.Tốt nhất là có đường cong hình chữ S để tránh khuếch đại thứ cấp hoặc các đường cong khuếch đại bất thường khác.
Giá trị CT
Số chu kỳ tương ứng với điểm uốn từ đường cơ sở đến tăng trưởng theo cấp số nhân là giá trị Ct.
Đối với cùng một mẫu, các đầu dò mồi khác nhau dẫn đến các đường cong khuếch đại khác nhau và giá trị Ct tương ứng sẽ bị ảnh hưởng bởi hiệu quả khuếch đại và mức độ nhiễu.Về lý thuyết, giá trị Ct của mẫu dò mồi mà chúng tôi chọn càng nhỏ thì càng tốt.
Hiệu suất khuếch đại
Một trong những phương pháp đáng tin cậy và ổn định nhất để đánh giá hiệu quả khuếch đại PCR là đường chuẩn, phương pháp này cũng được các nhà nghiên cứu công nhận rộng rãi.Phương pháp này liên quan đến việc tạo một loạt mẫu để kiểm soát số lượng mẫu mục tiêu tương đối.Các mẫu này thường được thực hiện bằng cách pha loãng nối tiếp các dung dịch gốc đậm đặc, thường được sử dụng nhất là pha loãng 10 lần.Sử dụng một loạt các mẫu đã pha loãng, sử dụng chương trình qPCR tiêu chuẩn để khuếch đại để thu được giá trị Cq, cuối cùng vẽ đường chuẩn theo nồng độ của từng mẫu và giá trị Cq tương ứng để thu được phương trình tuyến tính Cq= -klgX0+b, và hiệu suất khuếch đại E=10(-1 /k)-1.Khi sử dụng qPCR để phân tích định lượng, yêu cầu hiệu suất khuếch đại nằm trong khoảng 90%-110% (3,6>k>3,1).
Phát hiện mẫu có nồng độ thấp
Khi nồng độ mẫu thấp, tỷ lệ phát hiện của các đầu dò mồi khác nhau là khác nhau.Chúng tôi chọn 20 mẫu có nồng độ thấp để nhân rộng và hệ thống mồi-dò có tỷ lệ phát hiện cao nhất là tốt nhất.
Hệ số biến thiên (CV)
Có thể phát hiện 10 mẫu trùng lặp bằng các đầu dò mồi khác nhau theo tiêu chuẩn dòng của thuốc thử để phát hiện khuếch đại axit nucleic.
Thuốc thử định lượng:
Sự chính xác
Độ chính xác trong một lô phải đáp ứng: hệ số biến thiên (CV,%) của giá trị logarit của nồng độ thử nghiệm là ≤5%.Khi nồng độ mẫu thấp, hệ số biến thiên (CV,%) logarit của nồng độ phát hiện là ≤10%
Thuốc thử định tính:
Sự chính xác
Độ chính xác trong một lô phải đáp ứng:
(1) Hệ số biến thiên giá trị Ct (CV,%) ≤5%
Cùng một mẫu được kiểm tra song song trong 10 lần và kết quả kiểm tra phải nhất quán
Thời gian đăng: 18-09-2021
