Trong giai đoạn đầu của đợt bùng phát, do diễn biến nhanh nên việc chẩn đoán nhanh các bệnh nhân nghi ngờ là chìa khóa để ngăn chặn COVID-19.Một số thuốc thử phát hiện axit nucleic được phê duyệt có thời gian phát triển ngắn và có các vấn đề như xác nhận hiệu suất vội vàng, tối ưu hóa thuốc thử không đầy đủ và sự khác biệt lớn giữa các lô;Các vấn đề của các phòng thí nghiệm lâm sàng khác nhau trong các khía cạnh khác nhau của quy trình phát hiện axit nucleic cũng có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phát hiện axit nucleic.Bài viết này sẽ tập trung vào các liên kết và điểm chính trong quá trình phát hiện axit nucleic của SARS-CoV-2 hiện tại, đồng thời phân tích các vấn đề về âm tính giả và kiểm tra lại dương tính giả trong quá trình phát hiện axit nucleic trong phòng thí nghiệm và sự không thống nhất về mặt lâm sàng.

Nguyên tắc phát hiện axit nucleic của SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 là một loại virus RNA có trình tự bộ gen khoảng 29 kb, với 10 gen, có thể mã hóa hiệu quả 10 protein.Virus bao gồm RNA và protein, và lớp ngoài cùng là lớp phủ bên ngoài bao gồm lipid và glycoprotein.Bên trong, capsid protein bao bọc RNA trong đó, do đó bảo vệ RNA dễ phân hủy (P1).

Cấu trúc P1 của SARS-COV-2

Virus xâm nhập tế bào thông qua các thụ thể bề mặt tế bào cụ thể để gây nhiễm trùng và sử dụng tế bào chủ để nhân lên.

Nguyên tắc phát hiện axit nucleic của virus là phơi nhiễm RNA của virus thông qua dịch ly giải tế bào, sau đó sử dụng phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược huỳnh quang thời gian thực (RT-PCR) để phát hiện.

Chìa khóa của nguyên tắc phát hiện là sử dụng các đoạn mồi và mẫu dò để đạt được sự “khớp đúng mục tiêu” của các trình tự axit nucleic, nghĩa là tìm ra trình tự axit nucleic của SARS-CoV-2 khác với các loại vi-rút khác trong khoảng 30.000 cơ sở (độ giống nhau của axit nucleic với các loại vi-rút khác) vùng “Thấp”), thiết kế các đoạn mồi và mẫu dò.

Các đoạn mồi và mẫu dò rất phù hợp với vùng cụ thể của axit nucleic SARS-CoV-2, nghĩa là tính đặc hiệu rất mạnh.Khi kết quả khuếch đại RT-PCR huỳnh quang thời gian thực của mẫu được xét nghiệm là dương tính, điều đó chứng tỏ rằng SARS-CoV-2 có trong mẫu.Xem P2.

P2 Các bước xác định axit nucleic của SARS-CoV-2 (RT-PCR huỳnh quang thời gian thực)

Điều kiện, yêu cầu của phòng xét nghiệm phát hiện axit nucleic SARS-CoV-2

Các phòng thí nghiệm kiểm tra axit nucleic là lý tưởng nhất cho môi trường áp suất âm, và họ nên chú ý đến việc theo dõi áp suất, giữ cho không khí lưu thông và loại bỏ bình xịt.Nhân viên kiểm tra axit nucleic phải có trình độ chuyên môn tương ứng, được đào tạo về phản ứng chuỗi polymerase có liên quan và vượt qua bài đánh giá.Phòng thí nghiệm cần được quản lý chặt chẽ, khoanh vùng tại chỗ, nghiêm cấm nhân viên không liên quan vào.Khu vực sạch sẽ được thông gió và khử trùng tại chỗ.Các vật dụng có liên quan được đặt trong các khu vực, sạch và bẩn được phân tách, thay thế kịp thời và khử trùng tại chỗ.Khử trùng thường xuyên: Chất khử trùng có chứa clo là giải pháp chính cho các khu vực rộng lớn hơn và có thể sử dụng cồn 75% cho các khu vực nhỏ.Một cách tốt để đối phó với sol khí là mở cửa sổ để thông gió, và khử trùng không khí cũng có thể được thực hiện bằng tia cực tím, lọc và khử trùng không khí.

Các liên kết và thông số chính của xác định axit nucleic SARS-CoV-2 (RT-PCR huỳnh quang thời gian thực)

Mặc dù các phòng thí nghiệm thường rất chú ý đến việc “phát hiện” axit nucleic, nhưng trên thực tế, việc “chiết xuất” axit nucleic cũng là một trong những bước quan trọng để phát hiện thành công, có liên quan mật thiết đến việc thu thập và lưu trữ các mẫu vi rút.

Hiện nay, các mẫu đường hô hấp được sử dụng rộng rãi nhất, chẳng hạn như gạc mũi họng, sử dụng phương pháp thứ hai, đó là dung dịch khử hoạt tính (bảo quản) được điều chế dựa trên dung dịch chiết và ly giải axit nucleic.Một mặt, giải pháp bảo quản vi-rút này có thể làm biến tính protein của vi-rút, mất hoạt tính và không còn khả năng lây nhiễm, đồng thời nâng cao độ an toàn của giai đoạn vận chuyển và phát hiện;mặt khác, nó có thể trực tiếp bẻ khóa virus để giải phóng axit nucleic, loại bỏ enzyme phân hủy axit nucleic và ngăn chặn virus.ARN bị thoái hóa.

Dung dịch lấy mẫu vi rút được chuẩn bị trên cơ sở dung dịch ly giải chiết xuất axit nucleic.Các thành phần chính là muối cân bằng, chất tạo phức axit ethylenediaminetetraacetic, muối guanidine (guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, v.v.), chất hoạt động bề mặt anion (dodecane) Natri sulfat), chất hoạt động bề mặt cation (tetradecyl trimethyl ammonium oxalate), phenol, 8-hydroxyquinoline, dithiothreitol, proteinase K và một số hoặc nhiều thành phần khác.Hiện nay, có nhiều loại bộ dụng cụ chiết xuất axit nucleic và các loại thuốc thử chiết xuất và tinh chế axit nucleic khác nhau được sử dụng.Ngay cả khi sử dụng cùng một loại thuốc thử chiết xuất và tinh chế axit nucleic, quy trình chiết xuất của mỗi bộ dụng cụ đều khác nhau.

Hiện tại, các sản phẩm bộ phát hiện axit nucleic được Cục Quản lý Sản phẩm Y tế Quốc gia phê duyệt được lựa chọn dựa trên các gen ORF1ab, E và N trong bộ gen của SARS-CoV-2.Các nguyên tắc phát hiện của các sản phẩm khác nhau về cơ bản là giống nhau, nhưng mồi và thiết kế đầu dò của chúng là khác nhau.Có phân khúc mục tiêu đơn (ORF1ab), phân khúc mục tiêu kép (ORF1ab, N hoặc E) và phân khúc ba mục tiêu (ORF1ab, N và E).Sự khác biệt giữa phát hiện và giải thích, chiết xuất axit nucleic và hệ thống phản ứng RT-PCR huỳnh quang thời gian thực nên tham khảo các hướng dẫn của bộ dụng cụ có liên quan và người dùng nên tuân thủ nghiêm ngặt phương pháp giải đoán được chỉ định trong hướng dẫn của bộ dụng cụ để giải thích.Các vùng phổ biến, đoạn mồi và trình tự mẫu dò được khuếch đại bằng RT-PCR huỳnh quang thời gian thực được trình bày trong P3.

P3 Vị trí của mục tiêu khuếch đại SARS-CoV-2 trên bộ gen và trình tự của đoạn mồi và mẫu dò

Diễn giải kết quả xác định axit nucleic của SARS-CoV-2 (Real-Time RT-PCR huỳnh quang)

“Kế hoạch kiểm soát và phòng ngừa bệnh viêm phổi do lây nhiễm SARS-CoV-2 (Ấn bản thứ hai)” lần đầu tiên làm rõ tiêu chí đánh giá kết quả khuếch đại gen đơn lẻ:

1. Không có Ct hoặc Ct≥40 âm tính;

2. Ct<37 là dương tính;

3. Giá trị Ct từ 37-40 là vùng thang độ xám.Nên lặp lại thí nghiệm.Nếu kết quả làm lại Ct<40 và đường cong khuếch đại có các đỉnh rõ ràng thì mẫu được đánh giá là dương tính, ngược lại là âm tính.”

Phiên bản thứ ba của hướng dẫn và phiên bản thứ tư của hướng dẫn tiếp tục các tiêu chí trên.Tuy nhiên, do các mục tiêu khác nhau được sử dụng trong các bộ dụng cụ thương mại, ấn bản hướng dẫn lần thứ 3 đã nói ở trên không đưa ra tiêu chí để xác định sự kết hợp của các mục tiêu, nhấn mạnh rằng các hướng dẫn do nhà sản xuất cung cấp sẽ được áp dụng.Bắt đầu từ phiên bản thứ năm của hướng dẫn, hai mục tiêu đã được làm rõ, đặc biệt là các tiêu chí đánh giá cho một mục tiêu duy nhất khó đánh giá.Tức là nếu phòng xét nghiệm muốn xác nhận một ca dương tính với phát hiện axit nucleic SARS-CoV-2 thì cần đáp ứng 1 trong 2 điều kiện sau:

(1) Hai mục tiêu của SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) trong cùng một mẫu được xét nghiệm dương tính bằng RT-PCR huỳnh quang thời gian thực.Nếu một mục tiêu duy nhất là dương tính, thì cần phải lấy mẫu lại và xét nghiệm lại.Nếu kết quả xét nghiệm là Nếu mục tiêu duy nhất vẫn dương tính, nó được đánh giá là dương tính.

(2) Hai mẫu RT-PCR huỳnh quang thời gian thực cho thấy một mục tiêu dương tính cùng một lúc hoặc hai mẫu cùng loại cho kết quả xét nghiệm dương tính với một mục tiêu, có thể được đánh giá là dương tính.Tuy nhiên, hướng dẫn cũng nhấn mạnh rằng kết quả xét nghiệm axit nucleic âm tính không thể loại trừ khả năng nhiễm SARS-CoV-2.Cần loại trừ các yếu tố có thể gây ra âm tính giả, bao gồm chất lượng mẫu kém (mẫu hô hấp từ hầu họng và các bộ phận khác), lấy mẫu quá sớm hoặc quá muộn, mẫu không được bảo quản, vận chuyển và xử lý đúng cách, bản thân công nghệ có vấn đề (sự biến đổi của virus, ức chế PCR), v.v.

Nguyên nhân âm tính giả trong phát hiện SARS-CoV-2

Khái niệm “âm tính giả” trong xét nghiệm axit nucleic đang được quan tâm hiện nay thường dùng để chỉ “âm tính giả” trong đó kết quả xét nghiệm axit nucleic không phù hợp với biểu hiện lâm sàng, tức là các triệu chứng lâm sàng và kết quả hình ảnh rất nghi ngờ với COVID-19, nhưng xét nghiệm axit nucleic luôn cho kết quả “âm tính” nhiều lần.Trung tâm Phòng thí nghiệm Lâm sàng của Ủy ban Y tế Quốc gia đã giải thích về xét nghiệm SARS-CoV-2 “âm tính giả”.

(1) Trong tế bào của người nhiễm bệnh có một lượng vi rút nhất định.Dữ liệu hiện có cho thấy sau khi cơ thể bị nhiễm vi-rút, vi-rút sẽ xâm nhập vào cổ họng qua mũi và miệng, sau đó đến khí quản và phế quản, sau đó đến phế nang.Người nhiễm bệnh sẽ trải qua thời kỳ ủ bệnh, các triệu chứng nhẹ rồi đến quá trình các triệu chứng nặng và các giai đoạn bệnh khác nhau.Và số lượng virus hiện diện ở các bộ phận khác nhau của cơ thể là khác nhau.

Xét về tải lượng virus của các loại tế bào, tế bào biểu mô phế nang (đường hô hấp dưới) > tế bào biểu mô đường thở (đường hô hấp trên) > nguyên bào sợi, tế bào nội mô và đại thực bào, v.v.;từ loại mẫu, dịch rửa phế nang (tốt nhất)> đờm ho sâu> tăm bông mũi họng> tăm bông hầu họng> máu.Ngoài ra, virus cũng có thể được phát hiện trong phân.Tuy nhiên, xét đến sự thuận tiện trong thao tác và sự chấp nhận của bệnh nhân, thứ tự lấy mẫu lâm sàng thường được sử dụng là tăm bông hầu họng> tăm bông mũi họng> dịch rửa phế quản (thao tác phức tạp) và đờm sâu (thường là ho khan, khó lấy).

Do đó, lượng virus trong các tế bào vùng hầu họng hoặc vòm họng của một số bệnh nhân là nhỏ hoặc cực kỳ thấp.Nếu chỉ lấy mẫu hầu họng, mũi họng để xét nghiệm thì sẽ không phát hiện được axit nucleic của virus.

(2) Không có tế bào chứa vi-rút nào được thu thập trong quá trình lấy mẫu hoặc axit nucleic của vi-rút không được bảo quản hiệu quả.

[① Vị trí lấy mẫu không phù hợp, ví dụ như khi lấy mẫu bệnh phẩm hầu họng, độ sâu của mẫu lấy không đủ, mẫu bệnh phẩm lấy mẫu bệnh phẩm mũi họng không được lấy sâu trong khoang mũi, v.v. Hầu hết các tế bào được lấy có thể là tế bào không có vi rút;

②Gạc lấy mẫu được sử dụng không đúng cách.Ví dụ, các loại sợi tổng hợp như sợi PE, sợi polyester và sợi polypropylene được khuyên dùng cho vật liệu của đầu tăm bông.Các loại sợi tự nhiên như cotton được sử dụng trong thực tế (hấp thụ protein mạnh và không dễ bị rửa trôi) Và sợi nylon (hấp thụ nước kém, dẫn đến lượng mẫu không đủ);

③Sử dụng ống lưu trữ virus không đúng cách, chẳng hạn như sử dụng sai ống lưu trữ bằng nhựa polypropylene hoặc polyetylen dễ hấp thụ axit nucleic (DNA/RNA) dẫn đến nồng độ axit nucleic trong dung dịch lưu trữ giảm.Trong thực tế, nên sử dụng nhựa polyme polyetylen-propylen và một số hộp nhựa polypropylen được xử lý đặc biệt để lưu trữ axit nucleic của virus.]

[① Vị trí lấy mẫu không phù hợp, ví dụ như khi lấy mẫu bệnh phẩm hầu họng, độ sâu của mẫu lấy không đủ, mẫu bệnh phẩm lấy mẫu bệnh phẩm mũi họng không được lấy sâu trong khoang mũi, v.v. Hầu hết các tế bào được lấy có thể là tế bào không có vi rút;

②Gạc lấy mẫu được sử dụng không đúng cách.Ví dụ, các loại sợi tổng hợp như sợi PE, sợi polyester và sợi polypropylene được khuyên dùng cho vật liệu của đầu tăm bông.Các loại sợi tự nhiên như cotton được sử dụng trong thực tế (hấp thụ protein mạnh và không dễ bị rửa trôi) Và sợi nylon (hấp thụ nước kém, dẫn đến lượng mẫu không đủ);

③Sử dụng ống lưu trữ virus không đúng cách, chẳng hạn như sử dụng sai ống lưu trữ bằng nhựa polypropylene hoặc polyetylen dễ hấp thụ axit nucleic (DNA/RNA) dẫn đến nồng độ axit nucleic trong dung dịch lưu trữ giảm.Trong thực tế, nên sử dụng nhựa polyme polyetylen-propylen và một số hộp nhựa polypropylen được xử lý đặc biệt để lưu trữ axit nucleic của virus.]

(4) Hoạt động của phòng thí nghiệm lâm sàng không được chuẩn hóa.Điều kiện vận chuyển và bảo quản mẫu, quy trình vận hành tiêu chuẩn của các phòng thí nghiệm lâm sàng, giải thích kết quả và kiểm soát chất lượng là những yếu tố chính đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả xét nghiệm.Theo kết quả đánh giá chất lượng bên ngoài do Trung tâm Xét nghiệm Lâm sàng của Ủy ban Y tế Quốc gia thực hiện vào ngày 16-24 tháng 3 năm 2020, trong số 844 phòng xét nghiệm nhận được kết quả hợp lệ, 701 (83,1%) đạt tiêu chuẩn và 143 (16,9%) không đạt.Đủ tiêu chuẩn, điều kiện xét nghiệm tổng thể của phòng thí nghiệm là tốt, nhưng các phòng thí nghiệm khác nhau vẫn có sự khác biệt về khả năng vận hành của nhân sự, khả năng diễn giải mẫu dương tính đơn mục tiêu và kiểm soát chất lượng.

Làm cách nào để giảm âm tính giả khi phát hiện axit nucleic của SARS-CoV-2?

Việc giảm âm tính giả trong phát hiện axit nucleic nên được tối ưu hóa từ bốn khía cạnh tạo ra âm tính giả.

(1) Trong tế bào của người nhiễm bệnh có một lượng vi rút nhất định.Nồng độ của vi-rút ở các bộ phận khác nhau trên cơ thể của những người bị nghi ngờ nhiễm bệnh sẽ khác nhau vào các thời điểm khác nhau.Nếu không có hầu họng, nó có thể có trong dịch rửa phế quản hoặc phân.Nếu có thể thu thập nhiều loại mẫu cùng lúc hoặc ở các giai đoạn tiến triển khác nhau của bệnh để xét nghiệm, Sẽ giúp tránh được âm tính giả.

(2) Các tế bào chứa vi-rút nên được thu thập trong quá trình lấy mẫu.Vấn đề này có thể được giải quyết ở mức độ lớn bằng cách tăng cường đào tạo người thu thập mẫu.

(3) Thuốc thử IVD đáng tin cậy.Bằng cách thực hiện nghiên cứu về đánh giá hiệu suất phát hiện của thuốc thử ở cấp quốc gia và thảo luận về các vấn đề hiện có, hiệu quả phát hiện của thuốc thử có thể được cải thiện hơn nữa và độ nhạy của phân tích có thể được cải thiện.

(4) Tiêu chuẩn hóa hoạt động của các phòng thí nghiệm lâm sàng.Bằng cách tăng cường đào tạo nhân viên phòng thí nghiệm, liên tục cải tiến hệ thống quản lý chất lượng phòng thí nghiệm, đảm bảo sự phân chia hợp lý và nâng cao khả năng phát hiện của nhân viên, có thể giảm thiểu âm tính giả do vận hành phòng thí nghiệm không đúng cách.

Lý do xét nghiệm axit nucleic SARS-CoV-2 dương tính lại ở bệnh nhân đã hồi phục và xuất viện

“Kế hoạch chẩn đoán và điều trị COVID-19 (Phiên bản thử nghiệm thứ 7)” quy định rõ ràng rằng một trong những tiêu chí để bệnh nhân COVID-19 khỏi bệnh và xuất viện là hai mẫu bệnh phẩm đường hô hấp liên tiếp có kết quả xét nghiệm axit nucleic âm tính (cách nhau ít nhất 24 giờ), nhưng có rất ít trường hợp xét nghiệm axit nucleic SARS-CoV-2 dương tính trở lại ở những bệnh nhân đã xuất viện vì nhiều lý do.

(1)SARS-CoV-2 là một loại vi-rút mới.Cần phải hiểu thêm về cơ chế gây bệnh của nó, bức tranh đầy đủ về căn bệnh gây ra và đặc điểm của quá trình bệnh.Vì vậy, một mặt cần tăng cường quản lý bệnh nhân xuất viện và tiến hành theo dõi y tế 14 ngày.Thực hiện theo dõi, giám sát sức khỏe và hướng dẫn sức khỏe để hiểu sâu hơn về toàn bộ quá trình xuất hiện, diễn biến và hậu quả của bệnh.

(2)Người bệnh có thể bị nhiễm lại vi rút.Viện sĩ Zhong Nanshan cho biết: Do bệnh nhân khỏi bệnh có kháng thể nên SARS-CoV-2 có thể bị kháng thể đào thải khi chúng xâm nhập trở lại.Có rất nhiều nguyên nhân, có thể là nguyên nhân khiến bệnh nhân khỏi bệnh, hoặc có thể liên quan đến sự đột biến của virus, thậm chí là nguyên nhân do xét nghiệm trong phòng thí nghiệm.Nếu bản thân nó là vi-rút, đột biến SARS-CoV-2 có thể khiến kháng thể do bệnh nhân đã hồi phục tạo ra không có hiệu quả chống lại vi-rút đã biến đổi.Nếu bệnh nhân bị nhiễm lại vi-rút đột biến, xét nghiệm axit nucleic có thể dương tính trở lại.

(3) Đối với các phương pháp thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, mỗi phương pháp thử nghiệm đều có những hạn chế của nó.Việc phát hiện axit nucleic của SARS-CoV-2 là do lựa chọn trình tự gen, thành phần thuốc thử, độ nhạy của phương pháp và các lý do khác, dẫn đến các bộ dụng cụ hiện có có giới hạn phát hiện thấp hơn.Sau khi bệnh nhân được điều trị, virus trong cơ thể giảm đi.Khi tải lượng vi-rút trong mẫu được xét nghiệm thấp hơn giới hạn phát hiện thấp hơn, kết quả “âm tính” sẽ xuất hiện.Tuy nhiên, kết quả này không có nghĩa là virus trong cơ thể đã biến mất hoàn toàn.Virus có thể là sau khi ngừng điều trị.Resurgence”, tiếp tục sao chép.Do đó, nên xem lại mỗi tuần một lần trong vòng 2 đến 4 tuần sau khi xuất viện.

(4) Axit nuclêic là vật chất di truyền của virut.Virus bị tiêu diệt sau khi bệnh nhân đã trải qua quá trình điều trị bằng thuốc kháng vi-rút, nhưng các đoạn RNA của virus còn lại vẫn được giữ lại trong cơ thể người và không được đào thải hoàn toàn ra khỏi cơ thể.Đôi khi, trong những trường hợp nhất định, nó có thể được giữ lại nhiều hơn.Trong một thời gian dài, và tại thời điểm này, xét nghiệm axit nucleic sẽ dương tính “tạm thời”.Với việc kéo dài thời gian phục hồi của bệnh nhân, sau khi các đoạn RNA còn sót lại trong cơ thể dần cạn kiệt, kết quả xét nghiệm axit nucleic có thể chuyển sang âm tính.

(5) Kết quả xét nghiệm axit nucleic của SARS-CoV-2 chỉ chứng minh sự có mặt hay vắng mặt của RNA vi rút chứ không thể chứng minh hoạt động của vi rút và liệu vi rút có khả năng lây truyền hay không.Cần chứng minh bệnh nhân xét nghiệm lại axit nucleic dương tính có trở thành nguồn lây nhiễm trở lại hay không.Cần phải tiến hành nuôi cấy vi rút trên các mẫu lâm sàng và nuôi cấy vi rút “sống” để chứng minh rằng nó có khả năng lây nhiễm.

Bản tóm tắt

Tóm lại, không thể tránh hoàn toàn xét nghiệm axit nucleic SARS-CoV-2 cho kết quả âm tính giả, xét nghiệm lại dương tính và các tình trạng khác không phù hợp với biểu hiện lâm sàng.Trong sàng lọc và xét nghiệm thực tế, nên kết hợp các triệu chứng lâm sàng, kiểm tra hình ảnh (CT) và xét nghiệm Kết quả xét nghiệm (xét nghiệm axit nucleic + xét nghiệm kháng thể đặc hiệu với vi rút) để chẩn đoán toàn diện, tránh chẩn đoán sai và chẩn đoán sai.Nếu kết quả xét nghiệm được phát hiện rõ ràng không phù hợp với các biểu hiện lâm sàng, thì nên tiến hành phân tích toàn diện toàn bộ liên kết xét nghiệm (liên kết thu thập, lưu thông và xử lý mẫu) để loại trừ khả năng lây nhiễm vi rút SARS-CoV-2 sớm, nhiễm trùng tái phát hoặc kết hợp với các bệnh nhiễm vi rút đường hô hấp khác, v.v.Nếu có điều kiện nên lấy các mẫu nhạy cảm hơn như đờm hoặc dịch rửa phế nang để xét nghiệm lại.

Những sảm phẩm tương tự:

Bộ dụng cụ phát hiện axit nucleic SARS-CoV-2 (Phương pháp thăm dò huỳnh quang Multiplex PCR)