Nguyên liệu ban đầu: RNA
PCR phiên mã ngược định lượng (RT-qPCR) là một phương pháp thử nghiệm được sử dụng trong các thí nghiệm PCR sử dụng RNA làm nguyên liệu ban đầu.Trong phương pháp này, RNA tổng số hoặc RNA thông tin (mRNA) trước tiên được phiên mã thành DNA bổ sung (cDNA) nhờ enzyme phiên mã ngược.Sau đó, phản ứng qPCR được thực hiện bằng cách sử dụng cDNA làm mẫu.RT-qPCR đã được sử dụng trong nhiều ứng dụng sinh học phân tử, bao gồm phân tích biểu hiện gen, xác thực can thiệp RNA, xác thực microarray, phát hiện mầm bệnh, xét nghiệm di truyền và nghiên cứu bệnh.
Phương pháp một bước và hai bước cho RT-qPCR
RT-qPCR có thể được thực hiện bằng phương pháp một bước hoặc hai bước.RT-qPCR một bước kết hợp sao chép ngược và khuếch đại PCR, cho phép enzyme sao chép ngược và DNA polymerase hoàn thành phản ứng trong cùng một ống trong cùng điều kiện đệm.RT-qPCR một bước chỉ yêu cầu sử dụng đoạn mồi dành riêng cho trình tự.Trong RT-qPCR hai bước, phiên mã ngược và khuếch đại PCR được thực hiện trong hai ống, sử dụng các bộ đệm, điều kiện phản ứng và chiến lược thiết kế mồi được tối ưu hóa khác nhau.
Lợi thế | Điều bất lợi | |
Một bước | Phương pháp này có ít lỗi thí nghiệm hơn vì cả hai phản ứng đều được thực hiện trong một ống
Ít bước hút pipet hơn giúp giảm nguy cơ nhiễm bẩn
Thích hợp cho khuếch đại/sàng lọc thông lượng cao, nhanh và có thể lặp lại | Phản ứng hai bước không thể được tối ưu hóa riêng biệt
Vì các điều kiện phản ứng bị tổn hại khi kết hợp phản ứng hai bước nên độ nhạy không tốt bằng phương pháp hai bước
Số lượng mục tiêu được phát hiện bởi một mẫu duy nhất là nhỏ |
hai bước | Khả năng tạo các thư viện cDNA ổn định có thể được lưu trữ trong thời gian dài và được sử dụng trong nhiều phản ứng
Các gen mục tiêu và gen tham chiếu có thể được khuếch đại từ cùng một thư viện cDNA mà không cần nhiều thư viện cDNA
Bộ đệm phản ứng và điều kiện phản ứng cho phép tối ưu hóa các lần chạy phản ứng đơn lẻ
Lựa chọn linh hoạt các điều kiện kích hoạt | Sử dụng nhiều ống và nhiều bước hút pipet hơn sẽ làm tăng nguy cơ nhiễm bẩn DNA, và tốn thời gian.
Yêu cầu tối ưu hóa nhiều hơn so với phương pháp một bước |
Những sảm phẩm tương tự:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Một bước)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Một bước)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix để tổng hợp CDNA sợi đầu tiên
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Lựa chọn RNA tổng số và mRNA
Khi thiết kế thí nghiệm RT-qPCR, điều quan trọng là phải quyết định nên sử dụng RNA tổng số hay mRNA tinh khiết làm khuôn mẫu cho phiên mã ngược.Mặc dù mRNA có thể cung cấp độ nhạy cao hơn một chút, nhưng RNA tổng số vẫn thường được sử dụng.Lý do cho điều này là RNA tổng số có lợi thế quan trọng hơn với tư cách là nguyên liệu ban đầu so với mRNA.Đầu tiên, quy trình yêu cầu ít bước thanh lọc hơn, điều này đảm bảo phục hồi định lượng mẫu tốt hơn và chuẩn hóa kết quả tốt hơn để bắt đầu số lượng tế bào.Thứ hai, nó tránh được bước làm giàu mRNA, điều này có thể tránh được khả năng sai lệch kết quả do khả năng phục hồi khác nhau của các mRNA khác nhau.Nhìn chung, vì trong hầu hết các ứng dụng, việc định lượng tương đối của gen mục tiêu quan trọng hơn độ nhạy tuyệt đối của phát hiện, nên RNA tổng số phù hợp hơn trong hầu hết các trường hợp.
Mồi phiên mã ngược
Trong phương pháp hai bước, ba phương pháp khác nhau có thể được sử dụng để tạo mồi cho phản ứng cDNA: đoạn mồi oligo(dT), đoạn mồi ngẫu nhiên hoặc đoạn mồi theo trình tự cụ thể.Thông thường, mồi oligo(dT) và mồi ngẫu nhiên được sử dụng kết hợp.Các đoạn mồi này bám vào sợi mARN mẫu và cung cấp cho enzym phiên mã ngược một điểm khởi đầu để tổng hợp.
lựa chọn sơn lót | Cấu trúc và chức năng | Lợi thế | Điều bất lợi |
Sơn lót Oligo(dT) (hoặc sơn lót oligo(dT) neo) | Kéo dài quá trình ủ đến dư lượng thymine ở đuôi poly(A) của mRNA;mồi neo oligo(dT) chứa G, C hoặc A ở đầu 3′ (vị trí neo) | Tổng hợp cDNA có chiều dài đầy đủ từ mRNA có đuôi poly(A)
Áp dụng khi có ít nguyên liệu ban đầu hơn
Vị trí neo giữ đảm bảo đoạn mồi oligo(dT) liên kết với đuôi 5′ poly(A) của mARN | Chỉ thích hợp để khuếch đại gen có đuôi poly(A)
Thu được cDNA đã cắt ngắn từ vị trí gắn mồi*2 trong poly(A)
Xu hướng để liên kết với đầu 3′*
*Khả năng này được giảm thiểu nếu sử dụng mồi oligo(dT) neo |
sơn lót ngẫu nhiên
| Chiều dài từ 6 đến 9 base, có thể gắn vào nhiều vị trí trong quá trình phiên mã RNA | Ủ cho tất cả các RNA (tRNA, rRNA và mRNA)
Thích hợp cho các bảng điểm có cấu trúc thứ cấp quan trọng hoặc khi có ít tài liệu ban đầu hơn
Năng suất cDNA cao | cDNA được phiên mã ngược từ tất cả RNA, điều này thường không được mong muốn và có thể làm loãng tín hiệu của mRNA đích
lấy cDNA cắt ngắn |
mồi cụ thể theo trình tự | Đoạn mồi tùy chỉnh nhắm mục tiêu trình tự mRNA cụ thể | thư viện cDNA cụ thể
Cải thiện độ nhạy
Sử dụng đoạn mồi qPCR đảo ngược | Chỉ giới hạn trong việc tổng hợp một gen mục tiêu duy nhất |
Phiên mã ngược
Enzyme sao chép ngược là enzyme sử dụng RNA để tổng hợp DNA.Một số phiên mã ngược có hoạt tính RNase và có thể phân giải các sợi RNA trong chuỗi lai RNA-DNA sau khi phiên mã.Nếu nó không có hoạt tính enzym RNase, RNaseH có thể được thêm vào để đạt hiệu quả qPCR cao hơn.Các enzym thường được sử dụng bao gồm enzym sao chép ngược của virus gây bệnh bạch cầu ở chuột Moloney và enzym sao chép ngược của virus u nguyên bào tủy ở gia cầm.Đối với RT-qPCR, lý tưởng nhất là chọn một enzym phiên mã ngược có khả năng điều nhiệt cao hơn, để quá trình tổng hợp cDNA có thể được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, đảm bảo phiên mã thành công các RNA có cấu trúc bậc hai cao hơn, đồng thời duy trì hoạt động đầy đủ của chúng trong suốt phản ứng, dẫn đến hiệu suất cDNA cao hơn.
Những sảm phẩm tương tự:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
RNase H hoạt động của phiên mã ngược
RNaseH có thể phân hủy các chuỗi RNA từ các chuỗi kép RNA-DNA, cho phép tổng hợp hiệu quả chuỗi DNA kép.Tuy nhiên, khi sử dụng mRNA dài làm khuôn mẫu, RNA có thể bị phân hủy sớm, dẫn đến cDNA bị cắt ngắn.Do đó, thường có lợi khi giảm thiểu hoạt động RNaseH trong quá trình nhân bản cDNA nếu muốn tổng hợp các bản phiên mã dài.Ngược lại, các phiên mã ngược có hoạt tính RNase H thường có lợi cho các ứng dụng qPCR vì chúng tăng cường sự tan chảy của các chuỗi song công RNA-DNA trong chu kỳ PCR đầu tiên.
thiết kế sơn lót
Các đoạn mồi PCR được sử dụng cho bước qPCR trong RT-qPCR nên được thiết kế một cách lý tưởng để trải qua một điểm nối exon-exon, trong đó một đoạn mồi khuếch đại có thể có khả năng trải qua một ranh giới exon-intron thực tế.Vì các trình tự DNA bộ gen chứa intron không được khuếch đại nên thiết kế này giúp giảm nguy cơ dương tính giả được khuếch đại do nhiễm DNA bộ gen.
Nếu đoạn mồi không thể được thiết kế để phân tách các ranh giới exon hoặc exon-exon, thì có thể cần phải xử lý các mẫu RNA bằng DNase I hoặc DSDNase không chứa RNase để loại bỏ nhiễm DNA bộ gen.
Kiểm soát RT-qPCR
Nên đưa vào tất cả các thí nghiệm RT-qPCR một biện pháp kiểm soát âm tính phiên mã ngược (kiểm soát -RT) để phát hiện sự nhiễm bẩn DNA (chẳng hạn như DNA bộ gen hoặc các sản phẩm PCR từ các phản ứng trước đó).Kiểm soát này chứa tất cả các thành phần phản ứng ngoại trừ phiên mã ngược.Vì phiên mã ngược không xảy ra với điều khiển này, nên nếu quan sát thấy sự khuếch đại PCR, thì rất có thể có sự nhiễm bẩn từ DNA.
Thời gian đăng: 02-08-2022