Mọi người đang nói về nguyên tắc của thí nghiệm qRT-PCR, thiết kế mồi, giải thích kết quả, v.v., nhưng tôi nghĩ rằng tôi nên chia sẻ với bạn quy trình thí nghiệm của qRT-PCR.Nó nhỏ, nhưng đó là về kết quả.

Trước khi thực hiện qRT-PCR, chúng ta cần hiểu rõ về RNA của chính mình và phương pháp vận hành.Xét cho cùng, nỗ lực của chúng ta là nhằm đạt được kết quả, chứ không phải chỉ đơn giản là luyện tập.Vì vậy trước khi thực hiện qRT-PCR chúng ta cần xác định các vấn đề sau (một số vấn đề chỉ áp dụng được với SYBR).

1 Bạn có chắc RNA của bạn không bị suy giảm?

NanoDrop 2000 chỉ có thể phát hiện nồng độ và độ tinh khiết của RNA chứ không thể phát hiện tính toàn vẹn của RNA.

Giá trị RNA (RNA Intesity Number) có thể phản ánh tính toàn vẹn của RNA, được phát hiện bởi hệ thống Agilent 2100 Bioanalyzer.

Hình. Sơ đồ các giá trị RIN cho các mẫu RNA khác nhau (sinh vật nhân chuẩn)

Tuy nhiên, các phòng thí nghiệm thường không có Agilent 2100 Bioanalyzer.Trong trường hợp này, chúng ta có thể phát hiện thông qua gel formaldehyde, nhưng yêu cầu về tổng lượng RNA cao, vì vậy phương pháp nhanh nhất là sử dụng điện di trên gel thông thường.Yêu cầu phải ở trong môi trường không có nuclease nên cần tráng rửa bình điện di, bình sol, giá đỡ gel và lược bằng nước DEPC.Agarose cũng không chứa nuclease (miễn là nó mới được mở) và Loading Buffer nên được mở càng mới càng tốt, với 1,2% gel.

Lưu ý gel phải được hòa tan hoàn toàn, nếu không sẽ tạo thành các dải không đồng nhất, như ở mẫu 9 trong hình.Nếu điện áp quá cao hoặc chạy quá lâu sẽ sinh nhiệt và làm suy giảm RNA, vì vậy cần kiểm soát điện áp và thời gian hợp lý.Ngoài ra, chạy gel cũng có thể xác định thêm liệu có dư lượng DNA trong mẫu hay không và quan sát xem có một số lượng lớn các dải bị giữ lại trong giếng phân phối hay không.

Nhân vật.Phát hiện điện di trên gel của RNA

2 Bạn có chắc chắn về nồng độ cDNA của mình không?

Kinh nghiệm của các anh lớn trong phòng thí nghiệm là cDNA của hệ thống 20 ul thu được sau mỗi lần đảo ngược được pha loãng trực tiếp 20X, còn các chị sau tiến sĩ thì được pha loãng 10X.Tôi thường phụ thuộc vào tình hình.Bởi vì chất lượng của RNA được đề cập bởi mỗi người là khác nhau, mức độ đảo ngược cũng khác nhau và công nghệ đảo ngược có thể không ổn định.

Vì vậy, mỗi khi tôi lấy được cDNA đảo ngược, trước tiên tôi sẽ pha loãng nó khoảng 3 lần, sau đó sử dụng gen giữ nhà để thực hiện RT-PCR, số chu kỳ thường là 25 chu kỳ, để xác định nồng độ cụ thể, sau đó xác định hệ số pha loãng cuối cùng.

3 Bạn có chắc mồi của bạn dễ sử dụng không?

Nó có thể vượt qua đường cong nóng chảy của qRT-PCR, nhưng điều này vẫn tốn tiền.Đối với các phòng thí nghiệm không có nhiều kinh phí, khi lấy được nhiều mồi có thể sử dụng RT-PCR thông thường để xem có phải là đơn băng hay không và xác định tính đặc hiệu của mồi.Nếu phòng thí nghiệm không thiếu tiền, tính đặc hiệu của tất cả các mồi có thể được xác định một lần thông qua đường cong nóng chảy.

4 Bạn có chắc chắn rằng điều kiện thí nghiệm của bạn là phù hợp?

SYBR nên được bảo vệ khỏi ánh sáng mạnh, vì vậy hãy cố gắng tắt đèn trên cao khi thêm thuốc thử SYBR và chỉ cần sử dụng ánh sáng mờ để hoàn thành.

Bảo quản SYBR ở 4°C.Khi sử dụng, đảo nhẹ nhàng lên xuống để trộn đều tránh tạo bọt, không xoáy mạnh.

Một số em thích vẽ vạch lên bảng PCR vì sợ trộn mẫu là sai.Bởi vì các điểm đánh dấu của bạn rất có thể ảnh hưởng đến việc thu thập các tín hiệu huỳnh quang, tôi thường khuyên các học sinh lớp dưới sử dụng sổ ghi chép thí nghiệm để hỗ trợ ghi nhớ, như minh họa bên dưới.

Nhân vật.sơ đồ nạp mẫu qRT-PCR

5 Bạn có chắc là bạn đang làm đúng không?

Nhớ đeo găng tay, đeo găng tay, đeo găng tay, ba lần nói những điều quan trọng.

Để giảm độ phơi sáng của SYBR với ánh sáng, cá nhân tôi muốn thêm một mẫu trước, như thể hiện trong hình bên dưới.Theo kinh nghiệm, việc thêm một lượng nhỏ mẫu có khả năng gây ra lỗi lấy mẫu.Do đó, để giảm thiểu lỗi do thêm một lượng nhỏ mẫu, tôi thường tăng gấp đôi mẫu một lần nữa và tăng gấp đôi lượng khi thêm mẫu để giảm lượng H2O2 được thêm vào.

Nhân vật.Sơ đồ nạp qRT-PCR

Sau đó cấu hình hệ thống qRT-PCR như sau.

Nhân vật.sơ đồ chuẩn bị hệ thống qRT-PCR

LƯU Ý: Quá trình cấu hình cần được thực hiện trên đá.

Sau khi thêm mẫu, dán màng niêm phong trong suốt.Cố gắng không chạm tay vào bề mặt của màng niêm phong trong suốt, chỉ thao tác từ khoảng trống trên cả hai mặt của màng.Vì dấu vân tay cũng có thể ảnh hưởng đến việc thu tín hiệu huỳnh quang.Sau đó dùng máy ly tâm ly tâm nhanh trong 10 s ở tốc độ thấp để mẫu không bị treo trên tường.

Những sảm phẩm tương tự:

Bộ RT-qPCR trực tiếp cho tế bào

RT dễ dàng II